Summary

慢性リンパ球性白血病患者におけるメチル-CpG結合ドメイン捕捉に基づく包括的DNAメチル化解析

Published: June 16, 2017
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Summary

この研究では、最適化されたメチル-CpG結合ドメイン(MBD)配列決定プロトコルと、慢性リンパ球性白血病(CLL)患者において差別的にメチル化されたCpGリッチ領域を同定するための計算パイプラインについて記載する。

Abstract

癌における長い非コードRNA(lncRNA)の役割は、癌の発達および進行中のそれらの機構的機能の理解への関心の高まりから、最前線に来ている。それにもかかわらず、特に慢性リンパ球性白血病(CLL)において、lncRNAおよび癌における反復配列の全体的なエピジェネティックな制御は十分に研究されていない。この研究では、メチル結合ドメイン(MBD)タンパク質を用いた二本鎖メチル化DNA断片の免疫沈降に基づく捕捉、次世代シーケンシング(MBD-seq)に続くユニークなアプローチに焦点を当てています。 2つの予後サブグループ(5つのIGVH変異サンプル+ 5つのIGVH非変異サンプル)に属するCLL患者サンプルをこの研究で使用した。分析により、正常な健康対照と比較して5,800の過剰メチル化および12,570低メチル化CLL特異的差異的メチル化遺伝子(cllDMG)が明らかにされた。重要なことに、これらの結果は、いくつかのCLL特異的な、差異的にメチル化されたlncRNAを同定した鋭い要素、および予後の価値を潜在的に有するタンパク質コード遺伝子が含まれる。この研究は、CLL患者試料を用いた高度にCpGが豊富な領域における全体的メチル化プロファイルの包括的な解析のために開発されたMBD-seqおよびバイオインフォマティクスパイプラインの詳細なプロトコルを概説している。最後に、タンパク質コード遺伝子およびlncRNAを、パイロシーケンシングを用いて検証した。これは、CpGメチル化レベルを分析してMBD-seqプロトコールからの知見をさらに裏づける高度に定量的な方法である。

Introduction

近年、全世界のDNAメチル化プロファイルを解析するための次世代シーケンシング技術の使用が増えています。メチル化感受性制限酵素消化、およびメチルCpG特異的抗体を用いたメチル化DNAの免疫沈降に基づいて、ゲノムワイドメチル化アッセイ(マイクロアレイおよび非マイクロアレイベースの方法を含む)を開発した。

異常なDNAメチル化は、慢性リンパ球性白血病(CLL)を含む白血病およびリンパ腫の特徴の1つである。以前は、私たちを含むいくつかのグループが、ゲノムDNAの重亜硫酸塩変換、マイクロアレイベースの方法または全ゲノム配列決定1,2,3を用いて、異なるCLL予後サブグループおよび正常な健康なB細胞コントロールのDNAメチル化プロファイルを特徴付けた <sup class = "xref"> 4。ゲノムDNAの重亜硫酸塩の変換は、修飾されていないシトシンのウラシルへの脱アミノ化をもたらし、修飾メチル化シトシンをゲノムに残す。一旦変換されると、DNAのメチル化状態は、マイクロアレイベースまたは全ゲノムバイサルファイトシークエンシング(WGBS)のような異なる定量的または定性的方法を用いたPCR増幅および配列決定によって決定することができる。重亜硫酸塩変換に基づく方法は多くの利点を有し、DNAメチル化レベルを分析するために異なる癌型で広く使用されているが、この技術に関連するいくつかの欠点がある。 WGBSシークエンシングにより、より少ないDNA量で1塩基対の分解能が得られ、多数のサンプルを分析するのに最適なオプションです。しかしながら、この方法は、ゲノム5,6中の 5mCレベルと5hmCレベルとの間の改変を区別することができない。さらに、マイクロアレイに基づく方法は完全なcを提供しないゲノムの超過。

私たちの研究室7の最近の研究では、重亜硫酸塩変換ではなく、免疫沈降に基づく方法を用いて、CLL患者および正常な健常対照における全体的な規模で高度にCpGが豊富な差別的にメチル化された領域を同定した。 Inmethyl-CpG結合ドメイン(MBD)の次世代配列決定(MBD-seq)では、二本鎖断片化DNAの濃縮はCpGメチル化の程度に依存する。この方法は、重亜硫酸塩変換法の欠点を克服することができ、バイアスのないPCRおよびPCR非依存的な方法でCpGメチル化のゲノムワイドカバレッジを提供することもできる。さらに、重亜硫酸塩変換に基づくマイクロアレイ法とは異なり、MBD-seqを使用して、長い散在性核要素(LINE)、短い散在核要素(SINE)、長い末端反復配列(LTRS)などの反復要素のメチル化状態を分析することができる。 。しかしながら、亜硫酸水素塩の変換方法と比較して、MBD-seqプロトコルは比較的大量の入力DNAを必要とする。また、配列決定の質およびデータは、使用される抗体の特異性、親和性および品質に依存する。

現在の研究では、次世代シーケンシングのためにメチル化DNAを濃縮するための詳細なMBD-seqプロトコルについて説明しています。これは市販のメチル化DNA結合濃縮キット( 材料表に記載されている)と、メチル化シーケンシングデータを視覚化して解釈してCLL特異的なハイパーサイトおよびハイポメチル化領域を同定する計算パイプラインを使用しています。基本的に、この方法は、メチル化CpGで富化されたDNAを抽出するためのメチル化CpGとのヒトMBD2タンパク質相互作用のMBDの能力を利用し、メチル化DNAのハイスループットシーケンシングが続く。

Protocol

CLLサンプルを収集するための倫理的承認は、2007年5月21日から、次の登録番号:EPN Gbg dnr 239/07である。すべてのCLL患者は最近改訂された基準8に従って診断され、サンプルは診断時に収集された。研究の患者は、書面による同意が得られた後、スウェーデン西部の様々な血液学部門から含まれていた。この研究では、白血病細胞の腫瘍パーセンテージが70%以上であるCLL末梢?…

Representative Results

MBD-seqは最近、CLL患者および一致した正常な健常対照に対して行われ、CLL特異的差次的に過剰および低メチル化された遺伝子を同定した7 。 CLLおよび正常な健康サンプルから生成されたデータを分析するために使用される実験的および生物情報パイプラインを図1Aおよび1Bに示す 。これらの分析は、IGHV変異およびIGH…

Discussion

MBD-seqは、費用対効果の高い免疫沈降に基づく技術であり、完全なゲノムワイドカバレッジでメチル化パターンを研究するために使用できます。 MeDIP seq(メチル化DNA免疫沈降の後にシーケンシング)およびMBD-seqの両方が、CpGが豊富なメチル化DNAの濃縮をもたらす。しかしながら、MBD-seqは、MeDIP seq19と比較した場合、高度にCpGに富む領域への結合に対するより高い親和性を示す。メチル結合濃…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、スウェーデン研究評議会、スウェーデン癌協会、クヌート・アンド・アリス・ヴァレンベルグ財団(KAW)、およびフォア・ヴェストラゴタランセリージョン・オブ・ザ・イヤーによって支持された。

Materials

Dneasy Blood and tissue kit Qaigen 69504
Lymphoprep solution A X I S-S H I E L D 1114544
Nano drop 2000 Thermo Fischersceintific
TE buffer PH 8 Sigma aldrich 93283
Bioruptor standard sonication device Diagenode UCD-200
TPX bioruptor tubes 1.5ml Diagenode C30010010-300
3 M Sodium acetate Diagenode C03030002
E-gel iBase safe imager combo kit Thermo Fischersceintific G6465EU
E-gel 2% Agarose gels Thermo Fischersceintific G441002
Methylminer Methylated DNA enrichment kit Thermo Fischersceintific ME10025
Labquake Tube Shaker/Rotators Thermo Fischersceintific 415110
Dynal MPC-S Thermo Fischersceintific A13346
Vortex mixer VWR 12620-848
Absolute Ethanol Any company
70% Ethanool Any company
DNAse free water Milli Q
DNA precipitant (3M sodium acetate) Diagenode C03030002
Safe seal 1.5ml eppendorf tubes Eppendorf 4036-3204
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fischersceintific Q32851
Qubit 0.5ml tubes Thermo Fischersceintific Q32856
Qubit Thermo Fischersceintific Q32866
Illumina Hiseq2000 Platform Illumina
Water  Bath Grant
Heat block grant
Tube rotater Labquake

References

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Cite This Article
Subhash, S., Kanduri, M. Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients. J. Vis. Exp. (124), e55773, doi:10.3791/55773 (2017).

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