Omfattende DNA-methyleringsanalyse ved anvendelse af en methyl-CpG-bindingsdomæne-capture-baseret metode i patienter med kronisk lymfocytisk leukæmi
Summary
Dette arbejde beskriver en optimeret methyl-CpG-bindingsdomæne (MBD) sekventeringsprotokol og en beregningsrørledning til identifikation af differentielt methylerede CpG-rige regioner hos patienter med kronisk lymfocytisk leukæmi (CLL).
Abstract
Rollen af lange ikke-kodende RNA'er (lncRNA'er) i kræft kommer frem i forgrunden på grund af den voksende interesse for at forstå deres mekaniske funktioner under udvikling af kræft og progression. På trods af dette er den globale epigenetiske regulering af lncRNA'er og gentagne sekvenser i kræft ikke blevet undersøgt godt, især i kronisk lymfocytisk leukæmi (CLL). Denne undersøgelse fokuserer på en unik tilgang: Den immunpræcipitationsbaserede indfangning af dobbeltstrengede, methylerede DNA-fragmenter ved anvendelse af methyl-bindende domæne (MBD) proteiner efterfulgt af næste generations sekventering (MBD-seq). CLL patientprøver tilhørende to prognostiske undergrupper (5 IGVH-muterede prøver + 5 IGVH-ikke-muterede prøver) blev anvendt i dette studie. Analyse afslørede 5.800 hypermethylerede og 12.570 hypomethylerede CLL-specifikke differentielt methylerede gener (cllDMG'er) sammenlignet med normale sunde kontroller. Det er vigtigt, at disse resultater identificerede adskillige CLL-specifikke, differentielt methylerede lncRNA'er, rePetitive elementer og proteinkodende gener med potentiel prognostisk værdi. Dette arbejde beskriver en detaljeret protokol for en MBD-seq og bioinformatik pipeline udviklet til en omfattende analyse af globale methyleringsprofiler i højt CpG-rige regioner ved brug af CLL patientprøver. Endelig valideredes et proteinkodende gen og et lncRNA under anvendelse af pyrosequencing, hvilket er en meget kvantitativ metode til analyse af CpG-methyleringsniveauer for yderligere at bekræfte resultaterne fra MBD-seq-protokollen.
Introduction
Anvendelsen af næste generations sekventeringsteknikker til analyse af globale DNA-methyleringsprofiler er blevet stadig mere populært i de seneste år. Genom-brede methyleringsassays, herunder mikroarray- og ikke-mikroarray-baserede metoder, blev udviklet baseret på følgende: bisulfitomdannelsen af genomisk DNA, methyleringskänslig restriktionsenzymfordøjelse og immunpræcipitation af methyleret DNA under anvendelse af methyl CpG-specifikke antistoffer .
Aberrant DNA-methylering er et kendetegn ved leukæmi og lymfomer, herunder kronisk lymfocytisk leukæmi (CLL). Tidligere har flere grupper, herunder vores, karakteriseret DNA-methyleringsprofilerne fra forskellige CLL-prognostiske undergrupper og normale, sunde B-cellekontroller under anvendelse af bisulfitomdannelsen af genomisk DNA efterfulgt af mikromarraybaserede metoder eller helgenomsekvensering 1 , 2 , 3 , <Sup class = "xref"> 4. Bisulfitomdannelsen af genomisk DNA fører til deaminering af umodificerede cytosiner til uracil, hvilket efterlader de modificerede methylerede cytosiner i genomet. Efter omdannelse kan methyleringsstatusen for DNA'et bestemmes ved PCR-amplifikation og sekventering under anvendelse af forskellige kvantitative eller kvalitative metoder, såsom mikro-array-baseret eller helgenoms-bisulfit-sekventering (WGBS). Selvom bisulfit-konverteringsbaserede metoder har mange fordele og er meget udbredt i forskellige kræfttyper til analyse af DNA-methyleringsniveauer, er der nogle ulemper forbundet med denne teknik. WGBS sekventering tillader single-base-pair opløsning med lavere mængder af DNA og er den bedst egnede mulighed for at analysere et stort antal prøver. Denne metode undlader imidlertid at differentiere modifikationerne mellem 5 mC og 5 hmC niveauerne i genomet 5 , 6 . Desuden tilbyder microarray-baserede metoder ikke komplet cOverage af genomet.
I en nylig undersøgelse fra vores laboratorium 7 blev immunpræcipitationsbaserede metoder, snarere end bisulfitkonvertering, anvendt til at identificere højt CpG-rige, differentielt methylerede regioner i global skala hos CLL-patienter og normale sunde kontroller. Inmethyl-CpG-bindingsdomæne (MBD) næste generations sekventering (MBD-seq) afhænger berigelsen af dobbeltstrenget fragmenteret DNA af graden af CpG-methylering. Denne fremgangsmåde kan overvinde ulemperne ved bisulfitomdannelsesmetoden og kan også tilvejebringe genomomfattende dækning af CpG-methylering på en upartisk og PCR-uafhængig måde. Derudover kan MBD-seq i modsætning til bisulfit-konverteringsbaserede mikroarray-metoder anvendes til at analysere gentagelseselementers methyleringsstatus, såsom lange interspersed-nukleare elementer (LINE'er), korte interspersed-nukleare elementer (SINEs), lange terminale gentagelser (LTRS), Osv . Imidlertid sammenlignet med bisulfitomdannelsesmetoder,En MBD-seq-protokol kræver en relativt stor mængde input-DNA. Kvaliteten af sekventeringen læser også, og dataene afhænger af specificiteten, affiniteten og kvaliteten af de anvendte antistoffer.
Den nuværende undersøgelse forklarer en detaljeret MBD-seq-protokol til berigelse af methyleret DNA til næste generations sekventering. Den anvender et kommercielt methyleret DNA-bindings berigelse kit (opført i Materialetabellen ) samt en beregningsrørledning til visualisering og fortolkning af methylerings-sekventeringsdata for at identificere CLL-specifikke hyper- og hypomethylerede regioner sammenlignet med normale sunde kontroller. I grund og grund gør denne metode brug af MBD'ens evne til human MBD2-proteininteraktion med methylerede CpG'er til ekstraktion af DNA beriget med methylerede CpG'er, og dette efterfølges af høj-gennemstrømningssekvenseringen af methyleret DNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
MBD-seq er en omkostningseffektiv immunpræcipitationsbaseret teknik, der kan bruges til at studere methyleringsmønstre med komplet gennembrydende dækning. Både MeDIP-seq (methyleret DNA-immunpræcipitation efterfulgt af sekventering) og MBD-seq resulterer i berigelse af CpG-rich methyleret DNA. Imidlertid viser MBD-seq mere affinitet mod binding til stærkt CpG-rige regioner, når de sammenlignes med MeDIP-seq 19 . Ved anvendelse af et methylbindende berigelsessæt kan man fraktionere DNA'…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af Det Svenske Forskningsråd, Kræftens Bekæmpelse, Knut- og Alice Wallenbergfonden (KAW), og VD VästraGötalandsregionen.
Materials
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer PH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5ml | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5ml tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
References
- Kanduri, M., et al. Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 115 (2), 296-305 (2010).
- Cahill, N., et al. 450K-array analysis of chronic lymphocytic leukemia cells reveals global DNA methylation to be relatively stable over time and similar in resting and proliferative compartments. Leukemia. 27 (1), 150-158 (2013).
- Kanduri, M., et al. Distinct transcriptional control in major immunogenetic subsets of chronic lymphocytic leukemia exhibiting subset-biased global DNA methylation profiles. Epigenetics. 7 (12), 1435-1442 (2012).
- Kulis, M., et al. Epigenomic analysis detects widespread gene-body DNA hypomethylation in chronic lymphocytic leukemia. Nat Genet. 44 (11), 1236-1242 (2012).
- Booth, M. J., et al. Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. Science. 336 (6083), 934-937 (2012).
- Yu, M., et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell. 149 (6), 1368-1380 (2012).
- Subhash, S., Andersson, P. O., Kosalai, S. T., Kanduri, C., Kanduri, M. Global DNA methylation profiling reveals new insights into epigenetically deregulated protein coding and long noncoding RNAs in CLL. Clin Epigenetics. 8, 106 (2016).
- Hallek, M., et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood. 111 (12), 5446-5456 (2008).
- De Meyer, T., et al. Quality evaluation of methyl binding domain based kits for enrichment DNA-methylation sequencing. PLoS One. 8 (3), e59068 (2013).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Subhash, S., Kanduri, C. GeneSCF: a real-time based functional enrichment tool with support for multiple organisms. BMC Bioinformatics. 17 (1), 365 (2016).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Martinelli, S., et al. ANGPT2 promoter methylation is strongly associated with gene expression and prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Epigenetics. 8 (7), 720-729 (2013).
- Kopparapu, P. K., et al. Epigenetic silencing of miR-26A1 in chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma: Impact on EZH2 expression. Epigenetics. 11 (5), 335-343 (2016).
- Robinson, M. D., et al. Evaluation of affinity-based genome-wide DNA methylation data: effects of CpG density, amplification bias, and copy number variation. Genome Res. 20 (12), 1719-1729 (2010).
