Umfassende DNA-Methylierungsanalyse unter Verwendung einer Methyl-CpG-bindenden Domänen-Capture-basierten Methode bei chronischen lymphatischen Leukämie-Patienten
Summary
Diese Arbeit beschreibt ein optimiertes Methyl-CpG-Bindungsdomäne (MBD) Sequenzierungsprotokoll und eine rechnerische Pipeline zur Identifizierung von differentiell methylierten CpG-reichen Regionen bei chronischen lymphatischen Leukämie (CLL) Patienten.
Abstract
Die Rolle der langen nicht-kodierenden RNAs (lncRNAs) bei Krebs kommt in den Vordergrund, da das Interesse an dem Verständnis ihrer mechanistischen Funktionen während der Krebsentwicklung und -progression zunimmt. Trotzdem wurde die globale epigenetische Regulation von lncRNAs und repetitiven Sequenzen bei Krebs insbesondere bei chronischer lymphozytischer Leukämie (CLL) nicht gut untersucht. Diese Studie konzentriert sich auf einen einzigartigen Ansatz: die immunpräzipitationsbasierte Erfassung von doppelsträngigen, methylierten DNA-Fragmenten unter Verwendung von Methylbindungsdomänen (MBD) -Proteinen, gefolgt von einer Sequenzierung der nächsten Generation (MBD-seq). CLL-Patientenproben, die zu zwei prognostischen Untergruppen gehörten (5 IGVH-mutierte Proben + 5 IGVH-unmutierte Proben), wurden in dieser Studie verwendet. Die Analyse ergab 5.800 hypermethylierte und 12.570 hypomethylierte CLL-spezifische differentiell methylierte Gene (cllDMGs) im Vergleich zu normalen gesunden Kontrollen. Wichtig ist, dass diese Ergebnisse mehrere CLL-spezifische, differentiell methylierte lncRNAs identifiziertenPetitive Elemente und Protein-kodierende Gene mit potenziellem prognostischen Wert. Diese Arbeit skizziert ein detailliertes Protokoll für eine MBD-Seq- und Bioinformatik-Pipeline, die für die umfassende Analyse globaler Methylierungsprofile in hochcpG-reichen Regionen mit CLL-Patientenproben entwickelt wurde. Schließlich wurden ein Protein-kodierendes Gen und eine lncRNA mittels Pyrosequenzierung validiert, was eine hochquantitative Methode zur Analyse von CpG-Methylierungsniveaus ist, um die Befunde aus dem MBD-seq-Protokoll weiter zu bestätigen.
Introduction
Die Verwendung von Sequenztechniken der nächsten Generation zur Analyse globaler DNA-Methylierungsprofile wurde in den letzten Jahren zunehmend populär. Genom-weite Methylierungs-Assays, einschließlich Mikroarray- und Nicht-Mikroarray-basierte Methoden, wurden auf der Grundlage der folgenden entwickelt: die Bisulfit-Umwandlung von genomischer DNA, methylierungsempfindliche Restriktionsenzymverdauungen und die Immunpräzipitation von methylierter DNA unter Verwendung von Methyl-CpG-spezifischen Antikörpern .
Aberrant DNA-Methylierung ist eines der Kennzeichen der Leukämie und Lymphome, einschließlich der chronischen lymphatischen Leukämie (CLL). Früher charakterisierten mehrere Gruppen, einschließlich unserer, die DNA-Methylierungsprofile verschiedener CLL-prognostischer Untergruppen und normale, gesunde B-Zell-Kontrollen unter Verwendung der Bisulfit-Umwandlung von genomischer DNA, gefolgt von Mikro-Array-basierten Methoden oder Voll-Genom-Sequenzierung 1 , 2 , 3 , <Sup class = "xref"> 4. Die Bisulfit-Umwandlung von genomischer DNA führt zur Deamination von unmodifizierten Cytosinen zu Uracil, wobei die modifizierten methylierten Cytosine im Genom zurückbleiben. Nach der Umwandlung kann der Methylierungsstatus der DNA durch PCR-Amplifikation und Sequenzierung unter Verwendung unterschiedlicher quantitativer oder qualitativer Methoden, wie z. B. Mikro-Array-basierte oder Voll-Genom-Bisulfit-Sequenzierung (WGBS), bestimmt werden. Obwohl Bisulfit-umwandlungsbasierte Verfahren viele Vorteile haben und in verschiedenen Krebsarten weit verbreitet sind, um DNA-Methylierungsniveaus zu analysieren, gibt es einige Nachteile, die mit dieser Technik verbunden sind. Die WGBS-Sequenzierung ermöglicht eine Single-Base-Paar-Auflösung mit niedrigeren DNA-Mengen und ist die beste geeignete Option zur Analyse einer großen Anzahl von Proben. Diese Methode unterscheidet jedoch nicht die Modifikationen zwischen den 5 mC und 5 hmC Ebenen im Genom 5 , 6 . Darüber hinaus bieten Microarray-basierte Methoden nicht komplette cÜberleben des Genoms
In einer aktuellen Studie aus unserem Labor 7 wurden immunpräzipitationsbasierte Verfahren anstelle von Bisulfit-Umwandlung verwendet, um hochgradig CpG-reiche, differentiell methylierte Regionen auf globaler Ebene bei CLL-Patienten und normalen gesunden Kontrollen zu identifizieren. Inmethyl-CpG-bindende Domäne (MBD) Sequenzierung der nächsten Generation (MBD-seq), die Anreicherung von doppelsträngiger fragmentierter DNA hängt vom Grad der CpG-Methylierung ab. Dieses Verfahren kann die Nachteile des Bisulfit-Umwandlungsverfahrens überwinden und kann auch eine genomweite Abdeckung der CpG-Methylierung in einer unvoreingenommenen und PCR-unabhängigen Weise bereitstellen. Zusätzlich kann im Gegensatz zu auf der Basis von Bisulfit-umwandlungsbasierten Mikroarray-Methoden MBD-seq verwendet werden, um den Methylierungsstatus von sich wiederholenden Elementen zu analysieren, wie z. B. lange durchbrochene nukleare Elemente (LINEs), kurze durchbrochene nukleare Elemente (SINEs), lange terminale Wiederholungen (LTRS) Usw. Im Vergleich zu Bisulfit-Umwandlungsverfahren,Ein MBD-seq-Protokoll erfordert eine relativ große Menge an Input-DNA. Auch die Qualität der Sequenzierung liest und die Daten hängen von der Spezifität, Affinität und Qualität der verwendeten Antikörper ab.
Die aktuelle Studie erklärt ein detailliertes MBD-seq-Protokoll, um methylierte DNA für die Sequenzierung der nächsten Generation zu bereichern. Es verwendet ein kommerzielles, methyliertes DNA-Bindungsanreicherungs-Kit (aufgeführt in der Materialtabelle ) sowie eine rechnerische Pipeline zur Visualisierung und Interpretation von Methylierungssequenzdaten zur Identifizierung von CLL-spezifischen hyper- und hypomethylierten Regionen im Vergleich zu normalen gesunden Kontrollen. Grundsätzlich nutzt dieses Verfahren die Fähigkeit des MBD der humanen MBD2-Protein-Wechselwirkung mit methylierten CpGs, um mit Methyl-CpGs angereicherte DNA zu extrahieren, worauf die Hochdurchsatz-Sequenzierung von methylierter DNA folgt.
Protocol
Representative Results
Discussion
MBD-seq ist eine kostengünstige, immunpräzipitationsbasierte Technik, die verwendet werden kann, um Methylierungsmuster mit vollständiger genomweiter Abdeckung zu untersuchen. Sowohl MeDIP-Seq (methylierte DNA-Immunopräzipitation als auch Sequenzierung) und MBD-Seq führen zur Anreicherung von CpG-reicher methylierter DNA. Allerdings zeigt MBD-seq mehr Affinität zur Bindung an hoch-cpG-reiche Regionen im Vergleich zu MeDIP seq 19 . Unter Verwendung eines Methyl-bindenden Anreicherungs-Kits k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde vom schwedischen Forschungsrat, der schwedischen Krebsgesellschaft, der Knut- und Alice-Wallenberg-Stiftung (KAW) und den FoU VästraGötalandsregionen unterstützt.
Materials
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer PH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5ml | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5ml tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
References
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