Detta arbete beskriver ett optimerat metyl-CpG-bindningsdomän (MBD) sekvenseringsprotokoll och en beräkningsrörledning för identifiering av differentiellt metylerade CpG-rika regioner hos patienter med kronisk lymfocytisk leukemi (CLL).
Rollen av långa icke-kodande RNA (lncRNA) i cancer kommer fram i framkant på grund av ökat intresse för att förstå deras mekaniska funktioner under cancerutveckling och progression. Trots detta har den globala epigenetiska förordningen av lncRNA och repetitiva sekvenser i cancer inte undersökts väl, särskilt vid kronisk lymfocytisk leukemi (CLL). Denna studie fokuserar på ett unikt förhållningssätt: den immunprecipitationsbaserade infångningen av dubbelsträngade, metylerade DNA-fragment med användning av metyl-bindande domän (MBD) proteiner följt av nästa generations sekvensering (MBD-seq). CLL-patientprover som tillhörde två prognostiska undergrupper (5 IGVH-muterade prover + 5 IGVH-omuterade prover) användes i denna studie. Analys avslöjade 5 800 hypermetylerade och 12 570 hypometylerade CLL-specifika differentiellt metylerade gener (cllDMG) jämfört med normala friska kontroller. Viktigt är att dessa resultat identifierade flera CLL-specifika, differentiellt metylerade lncRNA, rePetitiva element och proteinkodande gener med potentiellt prognostiskt värde. I detta arbete beskrivs ett detaljerat protokoll för en MBD-seq- och bioinformatikpipeline som utvecklats för en omfattande analys av globala metyleringsprofiler i hög CpG-rika regioner med användning av CLL-patientprover. Slutligen validerades en proteinkodande gen och ett lncRNA med användning av pyro-sekvensering, vilket är en högt kvantitativ metod för att analysera CpG-metyleringsnivåer för att ytterligare bekräfta resultaten från MBD-seq-protokollet.
Användningen av nästa generationens sekvenseringsteknik för att analysera globala DNA-metyleringsprofiler har blivit allt populärare under de senaste åren. Genomövergripande metyleringsanalyser, innefattande mikroarray- och icke-mikroarraybaserade metoder, utvecklades baserat på följande: bisulfitomvandlingen av genomiskt DNA, metyleringskänslig restriktionsenzym-digestioner och immunutfällningen av metylerat DNA med användning av metyl-CpG-specifika antikroppar .
Aberrant DNA-metylering är en av kännetecknen för leukemi och lymfom, inklusive kronisk lymfocytisk leukemi (CLL). Tidigare har flera grupper, inklusive våra, karakteriserat DNA-metyleringsprofilerna för olika CLL-prognostiska undergrupper och normala, hälsosamma B-cellkontroller med användning av bisulfitomvandlingen av genom-DNA, följt av mikrometrisbaserade metoder eller genom genomsekvenser 1 , 2 , 3 , <Sup class = "xref"> 4. Bisulfitomvandlingen av genomiskt DNA leder till deaminering av omodifierade cytosiner till uracil, vilket lämnar de modifierade metylerade cytosinerna i genomet. När omvandlad kan DNA-metyleringsstatusen bestämmas genom PCR-amplifiering och sekvensering med användning av olika kvantitativa eller kvalitativa metoder, såsom mikrometrisbaserad eller helgenoms-bisulfit-sekvensering (WGBS). Även om bisulfitkonverteringsbaserade metoder har många fördelar och används ofta i olika cancertyper för att analysera DNA-metyleringsnivåer, finns det några nackdelar associerade med denna teknik. WGBS-sekvensering möjliggör enkelbasbaserad upplösning med lägre mängder DNA och är det bästa lämpliga alternativet för att analysera ett stort antal prover. Emellertid misslyckas denna metod att differentiera modifieringarna mellan 5 mC och 5 hmC-nivåerna i genomet 5 , 6 . Dessutom erbjuder microarray-baserade metoder inte komplett cOverage av genomet.
I en nyligen genomförd studie från vårt laboratorium 7 användes immunprecipitationsbaserade metoder, snarare än bisulfitkonvertering, för att identifiera högt CpG-rika, differentiellt metylerade regioner i global skala hos CLL-patienter och normala friska kontroller. Inmetyl-CpG-bindande domän (MBD) nästa generations-sekvensering (MBD-seq) beror anrikningen av dubbelsträngat fragmenterat DNA på graden av CpG-metylering. Denna metod kan övervinna nackdelarna med bisulfitomvandlingsmetoden och kan även tillhandahålla genomomsättning av CpG-metylering på ett opartiskt och PCR-oberoende sätt. Dessutom kan MBD-seq, till skillnad från bisulfitkonverteringsbaserade mikroarraymetoder, användas för att analysera metyleringsstatus för repetitiva element, såsom långa interspersed-kärnämnen (LINE), korta interspersed-kärnämnen (SINE), långa terminala upprepningar (LTRS), Etc. Emellertid, jämfört med bisulfitomvandlingsmetoder,Ett MBD-seq-protokoll kräver en relativt stor mängd inmatnings-DNA. Kvaliteten på sekvenseringen läser också och data beror på specificiteten, affiniteten och kvaliteten på antikropparna som används.
Den aktuella studien förklarar ett detaljerat MBD-seq-protokoll för berikning av metylerat DNA för nästa generations sekvensering. Den använder ett kommersiellt metylerat DNA-bindande anriknings kit (listat i materialtabellen ), liksom en beräkningsrörledning för att visualisera och tolka metyleringssekvenseringsdata för att identifiera CLL-specifika hyper- och hypometylerade regioner jämfört med normala friska kontroller. I grund och botten utnyttjar denna metod förmågan hos MBD för humant MBD2-proteininteraktion med metylerade CpGs för att extrahera DNA som är berikat med metylerade CpG, och detta följs av hög genomströmnings-sekvensering av metylerat DNA.
MBD-seq är en kostnadseffektiv, immunutfällningsbaserad teknik som kan användas för att studera metyleringsmönster med fullständig genomomsättning. Både MeDIP-seq (metylerad DNA-immunutfällning följt av sekvensering) och MBD-seq resulterar i anrikning av CpG-rik metylerad DNA. Emellertid visar MBD-seq mer affinitet mot bindning till starkt CpG-riksområden när man jämfört med MeDIP-sekvens 19 . Med användning av ett metylbindande anriknings-kit kan man fraktionera DNA-en till hög C…
The authors have nothing to disclose.
Studien stöddes av Vetenskapsrådet, Kräftsamhället, Knut- och Alice Wallenbergstiftelsen (KAW) och Västra Götalandsregionen.
Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
TE buffer PH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
TPX bioruptor tubes 1.5ml | Diagenode | C30010010-300 | |
3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
Absolute Ethanol | Any company | ||
70% Ethanool | Any company | ||
DNAse free water | Milli Q | ||
DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
Safe seal 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
Qubit 0.5ml tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
Water Bath | Grant | ||
Heat block | grant | ||
Tube rotater | Labquake |