Predizione del silenziamento del gene attraverso il controllo spatiotemporale della siRNA rilasciata da nanocarrier polimerici sensibili alla foto
Summary
Presentiamo un nuovo metodo che utilizza copolimeri a blocchi foto-reattivi per un controllo più efficace spatiotemporale del silencing del gene senza effetti off-target rilevabili. Inoltre, i cambiamenti nell'espressione genica possono essere predittivati utilizzando semplici test di rilascio siRNA e semplice modellizzazione cinetica.
Abstract
Nuovi materiali e metodi sono necessari per meglio controllare il rilascio vs rilascio di acidi nucleici per una vasta gamma di applicazioni che richiedono una precisa regolazione dell'attività genica. In particolare, nuovi materiali sensibili agli stimoli con un miglior controllo spatiotemporale sull'espressione genica potrebbero sbloccare piattaforme traducibili nella ricerca di farmaci e nelle tecnologie della medicina rigenerativa. Inoltre, una maggiore capacità di controllare il rilascio dell'acido nucleico da materiali consentirebbe lo sviluppo di metodi razionalizzati per prevedere a priori l' efficacia del nanocarrier, portando a uno screening accelerato dei veicoli di erogazione. In questo esempio, presentiamo un protocollo per prevedere efficienze di silenziamento del gene e raggiungere il controllo spaziale sull'espressione genica attraverso un sistema nanocarrier modulare fotoreattivo. Il piccolo RNA interferente (siRNA) è complessato con polimeri mPEG- b- poli (5- (3- (ammino) propossi) -2-nitrobenzilmetacrilato (mPEG- b -P (APNBMA))Rm stabili nanocarrier che possono essere controllati con luce per facilitare l'attivazione / disinserzione di siRNA sintonizzabile. Diamo due contesti complementari che impiegano spettroscopia di correlazione alla fluorescenza e elettroforesi gel per la quantificazione accurata del rilascio siRNA da soluzioni che imitano ambienti intracellulari. Le informazioni ottenute da questi saggi sono state incorporate in un modello cinetico di interferenza RNA (RNAi) per predire le risposte dinamiche di silenziamento a varie condizioni di foto-stimolo. A loro volta, queste condizioni ottimizzate di irradiazione permettevano di affinare un nuovo protocollo per controllare spatiotemporalmente il silenziamento del gene. Questo metodo può generare schemi cellulari nell'espressione genica con risoluzione di cellule a cellule e nessun effetto off-target rilevabile. Considerati insieme, il nostro approccio offre un metodo di facile utilizzo per prevedere cambiamenti dinamici nell'espressione genica e controllare esattamente l'attività di siRNA nello spazio e nel tempo. Questo insieme di saggi può essere facilmente adattato per testare un'ampia varietà di otI suoi sistemi sensibili agli stimoli per affrontare le sfide chiave pertinenti a una moltitudine di applicazioni nella ricerca e nella medicina biomedica.
Introduction
I piccoli RNA interferenti (siRNAs) mediano il silenziamento del gene post-trascrizionale attraverso un percorso catalitico RNAi altamente specifico, potente e adattabile a virtualmente qualsiasi gene bersaglio 1 . Queste caratteristiche promettenti hanno permesso alle terapeutiche siRNA di avanzare negli studi clinici umani per il trattamento di numerose malattie, tra cui il melanoma metastatico e l'emofilia 2 , 3 . Tuttavia, persistono problemi di consegna significativi che hanno ostacolato la traduzione 4 . In particolare, i veicoli di consegna devono rimanere stabili e proteggere gli siRNA dal degrado extracellulare, ma anche rilasciare il carico utile nel citoplasma 5 . Inoltre, molte applicazioni RNAi richiedono metodi migliorati per regolare il silenziamento del gene nello spazio e nel tempo 6 , che ridurrà gli effetti collaterali nelle terapie 7 di siRNA e consentirà di trasformare unDvances in applicazioni che vanno da microarray di cellule per la scoperta di droga 8 alla modulazione delle risposte delle cellule negli scaffolds rigenerativi 9 . Queste sfide evidenziano la necessità di nuovi materiali e metodi per controllare meglio il rilascio rispetto a rilascio nei nanocarrier di siRNA.
Una delle strategie più promettenti per controllare il rilascio di siRNA e migliorare la regolazione spaziale è l'uso di materiali sensibili alle stimoli 10 . Ad esempio, un'ampia varietà di biomateriali sono stati progettati con affinità di legame variabile di acido nucleico in risposta al potenziale alterato del redox o al pH, o campi magnetici applicati, ecografia o luce 11 . Sebbene molti di questi sistemi dimostrano un migliore controllo dell'attività dell'acido nucleico, l'utilizzo della luce come trigger è particolarmente vantaggioso grazie alla sua risposta temporale istantanea, alla precisa risoluzione spaziale e alla facilità di sintonizzazione <suP class = "xref"> 12. Inoltre, il potenziale delle tecnologie fotosensibili per la regolazione dell'espressione genica è stato dimostrato da un promotore inducibile all'avanguardia e da sistemi di regolazione ottogenetica; Tuttavia, questi sistemi soffrono di numerose sfide, incluse le capacità limitate per regolare i geni endogeni, i problemi di sicurezza come l'immunogenicità e le difficoltà nell'erogazione di gruppi multi-componente 13 , 14 e 15 . I nanocarrier siRNA rispondenti alla foto sono ideali per superare questi inconvenienti e fornire un approccio più semplice e più robusto per modulare l'espressione genica spatiotemporalmente 16 , 17 , 18 . Purtroppo, i metodi per predire in modo preciso la risposta alla rottura della proteina risultante rimangono inafferrabili.
Una sfida fondamentale è che le valutazioni quantitative di rilascio siRNA sonoRari 19 , 20 , e anche quando queste valutazioni vengono eseguite, non sono state accoppiate ad analisi della dinamica di turnover di siRNA / protein. Sia la quantità di siRNA rilasciata che la sua persistenza / vita sono determinanti importanti delle dinamiche di silenziamento del gene risultanti; Quindi, una mancanza di tali informazioni è una sconnessione principale che preclude una precisa predizione della risposta dose-RNAi 21 . Affrontare questa sfida accelererebbe la formulazione delle relazioni strutturali-funzioni appropriate nei nanocarri e informare meglio i progetti biomateriali 22 . Inoltre, tali approcci consentirebbero lo sviluppo di protocolli di dosaggio più efficaci di siRNA. Nel tentativo di comprendere la risposta dinamica di silenziamento, diversi gruppi hanno studiato modelli matematici di RNAi 23 , 24 , 25 . Questi quadri eranoRiuscito a fornire approfondimenti sulle trasformazioni mediate dal siRNA nell'espressione genica e identificando i passi di limitazione del tasso 26 . Tuttavia, questi modelli sono stati applicati solo ai sistemi di distribuzione genica commerciale ( ad es . Lipofectamine e Polyethylenimine (PEI)) che non sono in grado di controllare il rilascio di siRNA e la complessità dei modelli ha severamente limitato la loro utilità 27 . Queste carenze evidenziano una necessità insoddisfatta di nuovi materiali in grado di ottimizzare il rilascio di siRNA in combinazione con modelli di cinetica predittiva e facile da usare.
Il nostro metodo affronta tutte queste sfide attraverso l'integrazione di una piattaforma nanocarrier sensibile alla luce con metodi accoppiati per quantificare il libero siRNA e la dinamica di modello RNAi. In particolare, la rilascio preciso di siRNA 28 della nostra piattaforma è monitorata da due metodi complementari per la quantificazione accurata di encapsulated vs. unSiRNA legato. I dati sperimentali di questi saggi sono inseriti in un semplice modello cinetico per prevedere efficienze di silenziamento del gene a priori 29 . Infine, la natura on / off dei nanocarrier è facilmente sfruttata per generare modelli cellulari in espressione genica con controllo spaziale sulla scala di lunghezza cellulare. Quindi, questo metodo fornisce un metodo facilmente adattabile per controllare e prevedere il silenziamento del gene in una varietà di applicazioni che trarrebbero vantaggio dalla regolazione spaziale del comportamento delle cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono pochi passi nel metodo che sono particolarmente critici. Nella formulazione dei nanocarri, l'ordine di aggiunta di componenti e la velocità di miscelazione sono due parametri importanti che influenzano l'efficacia 39 . Questo protocollo richiede che la componente cationica, mPEG- b- P (APNBMA), venga aggiunta alla componente anionica, siRNA, in modo goccia mentre si vortexa. A seconda del volume totale di formulazione, questo processo di miscelazione richiede 3-6 s. Per …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano l'Istituto Nazionale delle Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali di Salute (NIH) per il sostegno finanziario attraverso un Premio di Sviluppo Istituzionale (IDeA) sotto il numero di sovvenzione P20GM103541 e il numero di sovvenzione P20GM10344615. Le affermazioni qui riportate non riflettono le opinioni del NIH. Riconosciamo inoltre l'Associazione Delaware Biotechnology (DBI) e l'Ufficio per lo Sviluppo economico di Delaware (DEDO) per il sostegno finanziario attraverso il Centro Bioscience per la tecnologia avanzata (Bioscience CAT) (12A00448).
Materials
| siRNA | Sigma-Aldrich | SIC001 | non-targeted, universal negative control |
| mPEG-b-P(APNBMA) | synthesized in our lab | N/A | photo-responsive polymer |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| rubber gasket | McMaster-Carr | 3788T21 | 0.5 mL thick |
| UV laser | Excelitas Technologies | Omnicure S2000 | collimating lens and 365 nm filter used |
| agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| siRNA labelled with Dy547 | GE Healthcare Dharmacon, Inc. | custom order | fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand |
| microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | pre-cleaned glass |
| Secure-Seal Spacer | Life Technologies | S24735 | double-sided adhesive |
| LSM 780 | Carl Zeiss | N/A | confocal microscope |
| ZEN 2010 | Carl Zeiss | N/A | FCS analysis software |
| MATLAB | MathWorks | N/A | programming language |
| NIH/3T3 cells | ATCC | ATCC CRL-1658 | |
| DMEM | Mediatech | 10-013-CV | growth media |
| fetal bovine serum | Mediatech | 35-011-CV | heat-inactivated |
| penicillin-streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 11058021 | transfection media |
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