स्क्रीनिंग परख के लिए उपंयास Endothelial भड़काऊ प्रतिक्रिया में शामिल नियामकों विशेषताएं
Summary
संवहनी endothelium कस नियंत्रण ल्युकोसैट भरती. अपर्याप्त ल्युकोसैट extravasation मानव भड़काऊ रोगों के लिए योगदान देता है । इसलिए, endothelial सक्रियण के उपंयास विनियामक तत्वों के लिए खोज भड़काऊ विकारों के लिए बेहतर चिकित्सा डिजाइन करने के लिए आवश्यक है । यहां, हम एक व्यापक पद्धति का वर्णन उपंयास endothelial नियामकों कि सूजन के दौरान ल्युकोसैट ्े संशोधित कर सकते है विशेषताएं ।
Abstract
endothelial परत कई विभिंन कार्यों को नियंत्रित करने से शरीर में homeostasis बनाए रखने के लिए आवश्यक है । endothelial परत द्वारा भड़काऊ प्रतिक्रिया का विनियमन कुशलतापूर्वक क्षतिग्रस्त क्षेत्रों की वसूली में हानिकारक आदानों और सहायता के खिलाफ लड़ने के लिए महत्वपूर्ण है । जब endothelial कोशिकाओं को एक भड़काऊ वातावरण के लिए उजागर कर रहे हैं, जैसे कि ग्राम के बाहरी घटक-नकारात्मक बैक्टीरिया झिल्ली, lipopolysaccharide (एलपीएस), वे घुलनशील समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस, जैसे Ccl5, Cxcl1 और Cxcl10 एक्सप्रेस, और ट्रिगर परिचालित ल्यूकोसाइट्स का सक्रियकरण । इसके अलावा, आसंजन के अणुओं की अभिव्यक्ति ई-selectin, VCAM-1 और िकैम-1 endothelial सतह पर ल्यूकोसाइट्स परत करने के लिए सक्रिय endothelial के संपर्क और आसंजन सक्षम बनाता है, और अंततः सूजन ऊतक की ओर extravasation । इस परिदृश्य में, endothelial फ़ंक्शन कसकर विनियमित किया जाना चाहिए क्योंकि ल्युकोसैट भर्ती में अत्यधिक या दोषपूर्ण सक्रियण भड़काऊ-संबंधी विकारों के लिए नेतृत्व कर सका । के बाद से इन विकारों के कई एक प्रभावी उपचार नहीं है, संवहनी परत पर ध्यान केंद्रित के साथ उपंयास रणनीतियों की जांच की जानी चाहिए । हम व्यापक परख कि उपंयास endothelial नियामकों की खोज के लिए उपयोगी है कि ल्युकोसैट समारोह को संशोधित करने का प्रस्ताव है । हम विशिष्ट अभिव्यक्ति ल्युकोसैट भर्ती में शामिल लक्ष्यों (जैसे, साइटोकिंस, chemokines, और आसंजन अणुओं) सहित कई तकनीकों के साथ, का उपयोग करके endothelial सक्रियण का विश्लेषण: वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया ( RT-qPCR), पश्चिमी दाग, प्रवाह cytometry और आसंजन परख । इन तरीकों भड़काऊ संदर्भ में endothelial समारोह का निर्धारण और बहुत स्क्रीनिंग परख प्रदर्शन करने के लिए उपंयास endothelial भड़काऊ नियामकों कि संभावित नए चिकित्सीय रणनीतियों के डिजाइन के लिए मूल्यवान है विशेषताएं उपयोगी होते हैं ।
Introduction
सूजन संक्रामक एजेंटों के खिलाफ एक लाभकारी जैविक प्रतिक्रिया, रोगज़नक़ को खत्म करने और क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरम्मत करने के लिए प्रमुख उद्देश्य के साथ है । कुछ शर्तों के तहत, जैसे जीर्ण संक्रमण या स्व-प्रतिरक्षित रोग, सूजन का समाधान नहीं है । इसके बजाय, वहां ल्यूकोसाइट्स के निरंतर घुसपैठ के साथ एक ंयायपालिका प्रतिक्रिया है, एक लंबे समय तक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है कि ऊतक नुकसान, फाइब्रोसिस, समारोह की हानि, और समग्र, विकलांगता और कुछ मामलों में रोगी की मौत की ओर जाता है में जिसके परिणामस्वरूप । इन मानव विकारों, भड़काऊ रोगों के रूप में सूचीबद्ध, सभी ल्युकोसैट extravasation1,2के नियंत्रण के लिए रक्त वाहिकाओं को शामिल ।
endothelial कोशिकाओं ल्युकोसैट तस्करी को नियंत्रित करके भड़काऊ प्रतिक्रिया के विनियमन में एक मौलिक भूमिका निभाते हैं । जब endothelial परत एलपीएस जैसे भड़काऊ मध्यस्थों के संपर्क में है, आराम endothelium सक्रिय करता है और समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, आदि) और आसंजन अणुओं (ई-selectin, VCAM-1 और िकैम-1) कि एहसान व्यक्त संक्रमण स्थल पर परिचालित ल्यूकोसाइट्स की भर्ती । ल्यूकोसाइट्स जारी साइटोकिंस तो मध्यस्थता रोलिंग और endothelial परत के साथ बातचीत के माध्यम से प्रधानमंत्री चिपकने वाला समकक्षों: PSGL-1 से selectin, α4β1 integrin को VCAM-1, और αLβ2 integrin को िकैम-1 । अंत में, ल्यूकोसाइट्स सूजन के ध्यान की ओर vasculature भर में माइग्रेट3.
भड़काऊ प्रतिक्रिया को विनियमित करने में endothelium की अनिवार्य भूमिका है कि आनुवंशिक रूप से एलपीएस रिसेप्टर, टोल रिसेप्टर 4 (TLR4) की तरह, केवल endothelial कोशिकाओं पर व्यक्त करने के लिए संशोधित किए गए चूहों पर प्रदर्शन किया गया है. इन endothelial-TLR4 जानवरों के लिए एक एलपीएस मध्यस्थता सूजन का जवाब और बैक्टीरिया टीका के बाद उत्पन्न संक्रमण का पता लगाने के लिए सक्षम थे, और नतीजतन जंगली प्रकार के रूप में समान स्तर पर संक्रमण के समाधान और अस्तित्व को प्राप्त करने के लिए4 चूहों , 5.
endothelium-विनियमित भड़काऊ प्रतिक्रिया मार्ग के लिए, यह माने किया गया है कि ल्युकोसैट-endothelium बातचीत के कुछ चरणों में अवरोध ट्रांस endothelial प्रवास और एक बेहतर पूर्वानुमान के लिए की कमी में परिणाम होगा भड़काऊ रोगों से संबंधित । वास्तव में, कई endothelial सक्रियण और ल्युकोसैट-endothelium बातचीत लक्ष्यीकरण रणनीतियों भड़काऊ विकारों के लिए एक इलाज के रूप में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के extravasation में बाधा6,7डिजाइन किया गया है ।
इस रिपोर्ट में, हम पूरी तरह से इन विट्रो तकनीकों के एक संपूर्ण समूह का वर्णन करने के लिए भड़काऊ उत्तेजना एलपीएस और संवहनी परत को ल्युकोसैट सक्रियण और आसंजन में अपनी भूमिका के जवाब में endothelial गतिविधि की विशेषता । इस पांडुलिपि में इस्तेमाल endothelial सेल मॉडल का माउस लंग endothelial सेल लाइन (आशोधित-04) था, जैसा कि Hortelano एट अल ने बताया है । 8. आशोधित-04 सेल लाइन को साहित्य में मान्य किया गया है endothelial सक्रियण9,10का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त प्रणाली है । अनुसंधान के हितों के आधार पर, इन तरीकों को आसानी से किसी भी endothelial या ल्युकोसैट प्रणालियों और भड़काऊ प्रोफ़ाइल extrapolated जा सकता है । एक बार चयनित स्थितियों में endothelial मापदंडों परिभाषित कर रहे हैं, प्रणाली प्रस्तावित प्रयोग पर उपंयास दवाओं का परीक्षण करने के लिए संवहनी सक्रियण का मूल्यांकन कर सकते हैं । इस भड़काऊ संदर्भ में, endothelium कोशिकाओं की यौगिक के साथ परीक्षण किया जा सकता है की तुलना में ब्याज की कोशिकाओं के नियंत्रण की स्थिति है, और किसी भी परिणामस्वरूप मतभेद के विकास और सूजन की प्रगति पर दवा के शकुन परिणाम को सूचित कर सकते हैं । समाप्त करने के लिए, हम एक प्रासंगिक प्रणाली endothelial कोशिकाओं है, जो उपंयास संवहनी भड़काऊ-संबंधित रोगों के खिलाफ विशिष्ट चिकित्सा के डिजाइन को प्रभावित कर सकते है के लिए नई दवा लक्ष्यों को चिह्नित करने का प्रस्ताव ।
Protocol
1. Endothelial सेल कल्चर ऊतक संस्कृति इलाज प्लेटें कोट १०० मिमी ऊतक संस्कृति प्लेटें २.५ मिलीलीटर जिलेटिन समाधान के साथ (autoclaved, ०.१ आसुत जल में% जिलेटिन) 30 मिनट के लिए ३७ & #176; C; इस आवश्यक अच्छी तरह से ?…
Representative Results
Discussion
इस endothelial प्रोटोकॉल एक stepwise प्रौद्योगिकी कि उपंयास भड़काऊ प्रतिक्रिया के विनियमन में शामिल तंत्र की खोज के लिए आधार स्थापित करता है का वर्णन । इन तरीकों एलपीएस द्वारा उत्तेजित endothelial गतिविधि के अध्ययन पर आ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) और Instituto de सैलड कार्लोस III (ISCIII) (अनुदान संख्या IERPY 1149/16 से अल के द्वारा समर्थित किया गया था; MPY 1410/09 to S. Hortelano); द्वारा MINECO के माध्यम से Fondo de Investigación en सैलड (वित्तीय संस्थाओं) (अनुदान संख्या pi 11.0036 और pi 14.0055 करने के लिए एस Hortelano). एस Herranz ISCIII से IERPY 1149/16 द्वारा समर्थित था ।
Materials
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/ml |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/ml |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/ml |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/ml |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/ml |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/ml |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/ml |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/ml |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/ml |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/ml |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10000 |
References
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation?. Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
- Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
- Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
- McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
- Chamorro, &. #. 1. 9. 3. ;., Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
- Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
- Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
- Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
- . SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013)
- Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- . Pierce BCA Protein Assay Kit Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017)
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
- . ImageJ User Guide Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017)
- Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).
- Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Tedgui, A., Mallat, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall. Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).
- Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
- Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149 (2014).
- Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
- Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).
