Скрининг Assays характеризовать Роман эндотелиальной регуляторы, участвующих в воспалительной реакции
Summary
Эндотелия строго контролирует лейкоцита вербовки. Неадекватные лейкоцита кровоподтек способствует воспалительных заболеваний человека. Таким образом Поиск новых нормативных элементов эндотелиальной активации необходимо разработать более терапии воспалительных заболеваний. Здесь мы описываем всеобъемлющей методологии характеризовать Роман эндотелиальной регуляторов, которые можно изменять, лейкоцитарные людьми во время воспаления.
Abstract
Эндотелиального слоя имеет важное значение для поддержания гомеостаза в организме, контролируя много различных функций. Регуляции воспалительной реакции эндотелиального слоя имеет решающее значение для эффективной борьбы против вредных материалов и помощи в восстановлении поврежденных участков. Когда эндотелиальные клетки подвергаются воспалительным среде, например компонент внешней мембраны грамотрицательных бактерий, липополисахарида (LPS), они выражают растворимых провоспалительных цитокинов, таких как Ccl5, Cxcl1 и Cxcl10 и вызвать Активация циркулирующих лейкоцитов. Кроме того экспрессии молекул адгезии VCAM-1 E-селектина и ИКАМ-1 на поверхности эндотелиальных позволяет взаимодействия и адгезии активации лейкоцитов эндотелиального слоя, и в конечном итоге кровоподтек на воспаленные ткани. В этом случае Эндотелиальная функция должна быть жестко регулируется потому, что чрезмерное или дефектных активации лейкоцитов наборе может привести к расстройств, связанных с воспалительным. Поскольку многие из этих расстройств не имеют эффективного лечения, Роман стратегии с упором на сосудистой слоя должны быть расследованы. Мы предлагаем всеобъемлющий анализов, которые полезны для поиска Роман эндотелиальной регуляторов, которые изменяют функции лейкоцитов. Мы анализируем эндотелиальной активации с помощью конкретным выражением целей участвующих в лейкоцитарной вербовки (например, цитокины, chemokines и молекулы адгезии) с несколько методов, в том числе: реального времени количественные полимеразной цепной реакции ( RT-qPCR), Западная блот, поток цитометрии и адгезии анализов. Эти подходы определения функции эндотелия в контексте воспалительных и очень полезны для выполнения анализов скрининг характеризовать Роман эндотелиальной воспалительных регуляторов, которые потенциально ценные для проектирования новых терапевтических стратегий.
Introduction
Воспаление является полезной биологической реакции против инфекционных агентов, с основной целью ликвидации возбудителя и ремонта поврежденных тканей. При определенных условиях, например, хронические инфекции или аутоиммунные заболевания воспаление не решить. Вместо этого есть ненормальная реакция с постоянной инфильтрации лейкоцитов, в длительной иммунной реакции, что приводит в результате повреждения тканей, фиброз, потеря функции и в целом, инвалидности и в некоторых случаях смерти пациента. Эти человеческие расстройств, каталогизированы как воспалительные заболевания, все связаны кровеносных сосудов для контроля лейкоцитов кровоподтек1,2.
Эндотелиальные клетки играют основополагающую роль в регуляции воспалительной реакции, контролируя лейкоцита людьми. Когда эндотелиального слоя подвергается воспалительных медиаторов таких ПЛАСТИНОК, отдыхая эндотелия активирует и выражает провоспалительных цитокинов (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1 и т.д.) и молекул адгезии (E-селектина, VCAM-1 и ИКАМ-1) что пользу набор циркулирующих лейкоцитов к месту инфекции. Лейкоциты, затем загрунтовать выпустила цитокинов посредником прокатки и взаимодействие с эндотелиального слоя через корреспондентские клей партнеров: PSGL-1-селектина, α4β1 Интегрин VCAM-1 и αLβ2 Интегрин ИКАМ-1. Наконец Лейкоциты мигрируют через сосудистую к фокус воспаления3.
Существенную роль эндотелия в регуляции воспалительной реакции была продемонстрирована на мышах, которые были генетически изменены выразить LPS рецепторов, Толл подобный рецептор 4 (TLR4), только на эндотелиальных клеток. Эти животные эндотелия TLR4 были в состоянии реагировать на LPS-опосредованной воспаление и выявления инфекции, сформированное после прививки бактерии и поэтому добиться разрешения инфекции и выживания на аналогичных уровнях как мышей дикого типа4 , 5.
Для пути эндотелий регулируемых воспалительной реакции были постулируется, что ингибирование на некоторых этапах взаимодействия лейкоцита эндотелия приведет к сокращению транс эндотелиальная миграции и лучше прогноз воспалительных заболеваний. В самом деле несколько стратегий, ориентация эндотелиальной активации и лейкоцитов эндотелия взаимодействия были разработаны для препятствовать кровоподтек иммунных клеток для лечения воспалительных заболеваний6,7.
В настоящем докладе мы описываем тщательное группы методов в vitro полностью охарактеризовать эндотелиальной деятельности в ответ на воспалительные стимул ПЛАСТИНОК и его роль в активации лейкоцитов и адгезии сосудистого слоя. Эндотелиальных клеток модель, используемая в этой рукописи был линии эндотелиальных клеток мыши легких (ТЗЭТ-04), как описано в Hortelano и др. 8. линия клетки ТЗЭТ-04 протестирована в литературе быть надлежащей системы для изучения эндотелиальной активации9,10. Основываясь на научных интересов, эти подходы могут быть легко экстраполированы на любом эндотелия или лейкоцитарные системы и воспалительных профиль. После того, как определены эндотелиальных параметров в выбранных условиях, система может проверить роман наркотиков на предлагаемых экспериментов для оценки сосудистой активации. В этом контексте воспалительных клетки эндотелия, протестированы с соединения интереса можно сравнить с условий управления клеток и разногласий результирующей может информировать наркотиков прогнозных результатов развития и прогрессирования воспаления. В заключение, мы предлагаем соответствующие системы для характеристики новых лекарственных препаратов на эндотелиальных клеток, которые могут повлиять на дизайн Роман терапии сосудистых конкретных против воспалительных заболеваний.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот эндотелиальной протокол описывает пошаговая технология, которая устанавливает основу для изучения новых механизмов, участвующих в регуляции воспалительной реакции. Эти подходы основаны на исследование эндотелиальной активности стимулируется ПЛАСТИНОК и оценить критические ш?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Ministerio де Economía y развитию (МИНЕКО) и Институту Salud Карлоса III (ISCIII) (Грант номер IERPY 1149/16 а.л.; МРУ 1410/09 для S. Hortelano); по МИНЕКО через Fondo de Investigación en Salud (FIS) (предоставляет номера PI11.0036 и PI14.0055 S. Hortelano). Эрранс Касадо S. было поддержано IERPY 1149/16 от ISCIII.
Materials
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/ml |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/ml |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/ml |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/ml |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/ml |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/ml |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/ml |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/ml |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/ml |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/ml |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10000 |
References
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation?. Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
- Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
- Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
- McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
- Chamorro, &. #. 1. 9. 3. ;., Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
- Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
- Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
- Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
- . SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013)
- Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- . Pierce BCA Protein Assay Kit Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017)
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
- . ImageJ User Guide Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017)
- Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).
- Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Tedgui, A., Mallat, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall. Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).
- Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
- Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149 (2014).
- Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
- Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).
