혈관 내 피는 단단히 백혈구 신규 모집을 제어합니다. 부적당 한 백혈구 넘쳐 흐름 인간의 염증 성 질병에 기여 한다. 따라서, 내 피 활성화의 새로운 규제 요소에 대 한 검색은 염증 성 질환에 대 한 향상 된 치료를 디자인 해야 합니다. 여기, 우리는 포괄적인 방법론 소설 내 피 레 귤 레이 터 백혈구 중 염증 매매 하는 것을 수정할 수 있는 특성을 설명 합니다.
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방법 논문
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혈관 내 피는 단단히 백혈구 신규 모집을 제어합니다. 부적당 한 백혈구 넘쳐 흐름 인간의 염증 성 질병에 기여 한다. 따라서, 내 피 활성화의 새로운 규제 요소에 대 한 검색은 염증 성 질환에 대 한 향상 된 치료를 디자인 해야 합니다. 여기, 우리는 포괄적인 방법론 소설 내 피 레 귤 레이 터 백혈구 중 염증 매매 하는 것을 수정할 수 있는 특성을 설명 합니다.
내 피 층은 여러 가지 기능을 제어 하 여 신체의 항상성 유지 하기 위한 필수적입니다. 내 피 층에 의해 염증 반응의 규칙은 효율적으로 유해한 입력에 대 한 싸움과 손상 된 지역의 복구에 도움이 중요 합니다. 내 피 세포는 선 동적인 환경, 그람 음성 세균 막, lipopolysaccharide (LPS)의 외부 구성 요소에 노출 되 면 그들은 Ccl5, Cxcl1 등 Cxcl10, 수용 성 프로 염증 성 cytokines를 표현 하 고 방 아 쇠는 순환 하는 백혈구의 활성화입니다. 또한, 내 피 표면에 접착 분자 전자 selectin VCAM-1, ICAM-1의 식 상호 작용 및 접착 내 피 레이어, 그리고 결국 염증된 조직 향해 넘쳐 흐름을 활성화 된 백혈구의 수 있습니다. 이 시나리오에서는 내 피 기능 해야 합니다 엄격 하 게 규제 되어야 백혈구 신규 모집에 과도 한 또는 결함이 활성화 염증 관련 질환으로 이어질 수 있기 때문에. 이후 많은 이러한 장애의 효과적인 치료를 하지 않아도, 혈관 층에 초점을 맞춘 새로운 전략을 조사 해야 합니다. 우리 소설 내 피 레 귤 레이 터 백혈구 기능을 수정 하는 검색에 유용한 종합적인 분석 제안 합니다. 우리를 포함 한 여러 가지 기술로 특정 식 대상 (예: cytokines, 발산, 및 접착 분자) 백혈구 신규 모집에 참여를 사용 하 여 내 피 활성화 분석: 실시간 정량 중 합 효소 연쇄 반응 ( RT-qPCR), 서쪽 오 점, cytometry 및 접착 분석 흐름. 이러한 접근 염증 맥락에서 내 피 기능을 결정 하 고 소설 내 피 염증 성 레 귤 레이 터 설계 새로운 치료 전략에 대 한 잠재적으로 가치 있는 특징을 심사 분석을 수행 하는 매우 유용 합니다.
염증은 병원 체를 제거 하 고 손상 된 조직을 복구 하는 주요 목적으로 전염 성 요원에 대 한 유익한 생물학 응답 이다. 만성 감염 또는 면역 질환과 같은 특정 조건에서 염증이 해결 되지 않습니다. 대신, 백혈구, 조직 손상, 섬유 증, 기능, 및 전반적인 손실, 장애 및 환자 일부의 경우 죽음에 리드 장기간된 면역 반응의 결과로의 지속적인 침투와 탈 선 반응이입니다. 이러한 인간의 장애, 염증 성 질환으로 카탈로그 모든 백혈구 넘쳐 흐름1,2의 컨트롤에 대 한 혈관 포함.
내 피 세포 백혈구 밀매를 제어 하 여 염증 반응의 규칙에 있는 근본적인 역할을 재생 합니다. 내 피 레이어 LPS 등 염증 성 중재자에 노출은, 휴식 endothelium 활성화 하 고 프로 염증 성 cytokines (Cxcl10 Cxcl5, Cxcl1, 등)와 접착 분자 (전자 selectin VCAM-1, ICAM-1)를 표현 하 고 그 은혜 순환 하는 백혈구는 감염의 사이트에 모집 다음 릴리스 cytokines에 의해 액 백혈구 중재 압 연 및 특 파 원 접착제 대응을 통해 내 피 레이어와 상호 작용: selectin, α4β1 integrin....
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1. 내 피 세포 배양
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실시간 정량 Pcr에 의해 LPS 유발 내 피 세포 활성화의 평가
굶 어 혈 청 MLEC-04 셀 100 ng/mL LPS의 6 h에 의해 자극 되었다 그리고 내 피 유전자 발현 비교 활성화 마커 휴식 상태를 표현 하 여 실시간 정량 Pcr를 사용 하 여 평가 했다. 그림 1A같이 LPS incubated MLEC-04 세포 염증 반응 (전자 selectin VCAM-1, ICAM-1) 동안 백혈구 신규 모집에 관련 된 선택 된 접착 분자의 mRNA 표현 유도. PECAM-1 식이 실험적인 치료에서 수정 되지 않은 때문에 내부 제어로 사용 되었다. 그림 1B LPS cytokines Ccl5, Cxcl10, 및 Cxcl1의 증가 mRNA 식으로 측정 하 여 내 피.......
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이 내 피 프로토콜 탐험 소설 메커니즘 염증 반응의 조절에 관여에 대 한 기초를 설정 하는 단계적 기술을 설명 합니다. 이러한 방식을 내 피 활동 LPS에 의해 자극된의 연구에 기초 하 고 특히 백혈구 신규 모집 선 동적인 응답 동안에 관련 된 중요 한 단계를 평가: cytokines 내 피, 내 피 접착 분자 표정 및 백혈구 접착 혈관 층에. 내 피 매개 변수가 설정 되 면 시스템 내 피 기능의 규정에 관련 된 소설 화합물에 대 한 검색할 수 있습니다 따라서, 염증 진행. 그 규제 약물 제약 시장에 대 한 관심의 수 있습니다. 이 순차 프로토콜의 주요 투영 물질로 조건 내 피 종류에 그들의 상대 혈관 활동 매개 변수를 조정 하 여 이러한 연구를 확장 하기 위한 기초입니다.
이 심사에 의해 선정 하는 마약 염증 성 질환에 대 한 새로운 치료 전략을 설계에 대 한 재미 있는 후보자를 창설할 것 이다. 한편으로, 내 피 응답을 선호 하 고 백혈구 신규 모집을 하는 화합물 면역 결핍 .......
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저자는 공개 없다.
이 작품은 정부의 드 Economía y Competitividad (MINECO) 및 Instituto de에 의해 지원 되었다 건배 카를로스 3 세 (ISCIII) (보조금 번호 IERPY 1149/16 앨 러 배 마; MPY 1410/09 S. Hortelano에); 의해 Fondo 드 Investigación en 건배 (FIS) (S. Hortelano PI11.0036-PI14.0055 번호 부여)을 통해 MINECO. S. Herranz IERPY 1149/16 ISCIII에서 지원 되었다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 젤라틴 | 시그마 | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| 소 태아 혈청 | 시그마 | A4503 | |
| 페니실린 스트렙토마이신 | Lonza | DE17-602E | |
| 트립신 | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | 시그마 | ED2SS | |
| LPS | 시그마 | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA 추출 버퍼 |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | qPCR용 형광 염색 |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| 세포 분석 튜브 | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | 비이온 성 계면 활성제 |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| 염화나트륨 | Merck | 1,064,041,000 | |
| 피로 인산 나트륨 | 시그마 | 221368 | |
| 불화 나트륨 | 시그마 | S7920 | |
| 오르토 바나 데이트 | 나트륨 시그마 | 13721-39-6 | |
| 프로테아제 억제제 칵테일 | 시그마 | P8340 | |
| 피어스 BCA 단백질 분석 키트 | 피어스 | 23225 | 비신 코닌산 분석 용 시약 |
| &베타; -메르캅토 에탄올 | 머크 | 805,740 | |
| PVDF 전달 멤브레인, 0.45 &마이크로; m | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | 폴리소르베이트 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| 콜라겐 유형 I | Sigma | c8919 | |
| 아세트산 | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan 블루 | Sigma | T8154 | |
| 파라포름알데히드 | Sigma | P6148 | |
| 메탄올 | Panreac | 1,310,911,612 | |
| 크리스탈 바이올렛 | Sigma | HT90132 | |
| 구연산나트륨 | Sigma | C7254 | |
| 에탄올 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | 다중 모드 마이크로플레이트 리더 |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel 문서화 시스템 |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR 시스템 |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | 카탈로그 번호< | strong>Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | 10 µ에서 사용; g/mL |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | 10 µ에서 사용; g/mL |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | 10 µ에서 사용; g/mL |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | 10 & 마이크로에서 사용; g/mL |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | 10 &마이크로에서 사용; g/mL |
| 항-쥐 IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | 10 & 마이크로에서 사용; g/mL |
| 안티 아르메니아 햄스터-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | 10 & 마이크로에서 사용; g/mL |
| 쥐 IgG 이소티오프 제어 | Invitrogen | 10700 | 10 & 마이크로에서 사용; g/mL |
| 아르메니아 햄스터 IgG 이소타입 제어 | Invitrogen | PA5-33220 | 10 µ에서 사용; g/mL |
| P-I&카파; &베타;-&알파; | 세포 신호 | 2859 | 10 µ에서 사용; g/mL |
| β-Actin | Sigma | A5441 | 10 &마이크로에서 사용; g/mL |
| P-ERK | 세포 신호 | 9101 | 10 & 마이크로에서 사용; g/mL |
| 안티 마우스 HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | 1:10,000에서 사용 |
| 안티 토끼 HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | 1:10,000에서 사용 |
| 안티 랫 HRP | Santa Cruz | sc-3823 | 1:10,000에서 사용 |
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