הפרוטוקולים הציג מתארים כיצד לבצע וזמינותו עיכוב hemagglutination לכמת נוגדן ספציפי שפעת titers מן הדוגמאות סרום מקבלי החיסון נגד שפעת. הבדיקה הראשונה קובע ריכוזים מיטביים אנטיגן ויראלי על-ידי hemagglutination. הבדיקה השניה מכמתת נוגדן ספציפי שפעת titers על ידי עיכוב hemagglutination.
נוגדנים titers משמשים כסמני הפונדקאית להגנה סרולוגית נגד שפעת, פתוגנים אחרים. מידע מפורט על ייצור נוגדנים מראש, שלאחר חיסון נדרש להבין חסינות חיסון-induced. מאמר זה מתאר פרוטוקול נקודה-מאת-נקודת אמין לקביעת נוגדן ספציפי שפעת titers. הפרוטוקול הראשון מתאר שיטה כדי לציין הכמויות אנטיגן הדרושים עבור hemagglutination, דיפרנצילי המשקלל הריכוזים לשימוש עוקבות בפרוטוקול השני (hemagglutination assay, HA assay). פרוטוקול השני מתאר כימות של נוגדנים ספציפיים שפעת titers נגד זנים ויראלי באמצעות טורי לדילול האדם סרום או תא תרבות supernatants (hemagglutination עיכוב assay, HI assay).
כדוגמה יישומית, אנו מראים את התגובה נוגדן של עמית בריאים, אשר קיבל חיסון שפעת מוחלש. בנוסף, אשיג בין וירוסים שפעת שונים מוצג, שיטות כדי למזער אשיג באמצעות סוגים שונים של תאי דם אדומים בעלי חיים (RBCs) מוסברים. הדיון מדגיש את היתרונות ואת החסרונות של מבחני הציג איך הקביעה של נוגדנים ספציפיים שפעת titers יכול לשפר את ההבנה של חסינות הקשורות החיסון.
זיהום בנגיף שפעת מזוהה עם ניכר תחלואה, תמותה גבוהה עלויות הבריאות1,2,3,4. בפרט, קשישים, תינוקות, נשים בהריון, חולים עם מחלה כרונית נמצאים בסיכון לתוצאות קליניות חמורות יותר. לכן, חיסון נגד במחזור זני וירוס שפעת היא המדד העיקרי להפחתת הנטל של המחלה בקרב אוכלוסיות בסיכון גבוה אלה. העלייה של התגובה החיסונית בודדים לאחר החיסון, למשל, נוגדנים ספציפיים שפעת מעל סף מגן, מפחיתה את הסיכון בודדים של זיהום ובאופן כללי את הסבירות של שידור ויראלי בתוך אוכלוסיה 5. הבנה מפורטת של חיסון-induced ההורמונאלית התגובה החיסונית באוכלוסיות שונות ועל -פני בקבוצות גיל שונות הוא רכיב מפתח כדי לענות על שאלות קליניות חשובות-6,–7,–8 , 9, כגון: למה יש חלק מהחולים הקשישים זיהומים למרות החיסון הקודם? מהו “טוב” ו- “מספיק” חיסון-induced להגנה? באיזו תדירות צריך חיסון להיות מוחל על חולים immunosuppressed להגיע titers מגן? מהו המינון היעיל ביותר? מהי ההשפעה של אדג’וונט הרומן על חיסון שלאחר נוגדן titers? המדד של ייצור נוגדנים ספציפיים חיסון עשוי לעזור לענות על שאלות חשובות אלה ולשפר את תוצאות חיסון.
כימות של נוגדנים ספציפיים וירוס titers יכול להתבצע עם שיטות חיסוניות שונות. זה כולל מוצק-שלב10 או מבוסס-חרוז אליסה11 מבחני HI assay12, מבחני נטרול13. שיטות מבוססות-אליסה לאפשר ההקרנה של כמויות גדולות יחסית של הדוגמאות סרום נגד אנטיגנים שונים. כמו כן, אימונוגלובולינים (Ig) M ו- IgG ספציפי פתוגן ניתן בנפרד לסייר. למרות המאפיינים של אנטיגן, למשל, רצף ליניארי חומצת אמינו או חלקיקים דמויי וירוס עשוי להשפיע על הכריכה של נוגדנים, הספקטרום של epitopes פוטנציאלי רחב מאוד, ואינו מספק מידע על אם נוגדן התגובה יש רלוונטיות פונקציונלי.
לעומת זאת, וזמינותו ניטרול קובע את הפוטנציאל של נוגדנים באופן פונקציונלי לעכב את הזיהום של תאים, לכן ומשקף הניטרול פוטנציאליים. עם זאת, שיטה זו היא עבודה מאוד אינטנסיבית, דורש culturing של ספציפי תא קווים ולחיות וירוסים, לכן, זה זמן רב, יקר, והוא דורש ציוד מיוחד.
מאמר זה מתאר שלב אחר שלב פרוטוקול מבוסס-ארגון הבריאות העולמי WHO HI12 לכמת נוגדן ספציפי שפעת titers. Hemagglutination היא תופעת האופיינית של וירוסים מסוימים שמוביל התלכדות של אריתרוציטים. עיכוב של האפקט הזה עם המטופל סרה מאפשר מדידת ריכוז נוגדן מעכבות, אשר משקף השפעה ניטרלית.
יש לשנות את זרימת העבודה של הפרוטוקול-המי כדי לאפשר טיפול יעיל יותר של דוגמאות מרובות במקביל, ובכך מקצר את הזמן הנדרש. הפרוטוקול הראשון מתאר את הקביעה של הפוטנציאל התלכדות של אנטיגן מסוים שפעת. בעשותו כן, נקבע ריכוז אנטיגן שפעת הנכון עבור פרוטוקול השני. החלק הזה יש לחזור עם כל אנטיגן ויראלי חדש, כמו גם כל אצווה של דם.
פרוטוקול השני מתאר את הקביעה של נוגדנים ספציפיים שפעת titers. הפרוטוקולים הציג ממוטבים עבור החקירה של וירוס שפעת ודוגמאות בנסיוב אדם לעומת זאת, אותה ניתן להחיל גם הדוגמאות סרום העכבר או תרבית תאים supernatants מ מגורה תאים חיסוניים, למשל, תאי-B וירוסים ספציפיים. תוצאות יכול להיקבע כמו titers נמדד מוחלטת. במחקרים רבים חיסון, את titers הגיאומטרי ועל סמך 95% מוצגים עבור כל אוכלוסייה מסוימת. פרשנות, seroprotection או seroconversion משמשים לעתים קרובות כדי לתאר את הרגישות של אוכלוסיה לוירוס מסוימים. Seroprotection מוגדרת כייל של ≥1:40, seroconversion כמו כייל נוגדנים 4-fold יותר מ להגביר עם הישג של seroprotective titers בין שתי נקודות זמן (הנפוץ ביותר לפני מתן החיסון, חיסון שלאחר 30 יום משמשים).
פרוטוקולים קל לשימוש, הם ניתן להתאים למגוון רחב של שאלות המחקר. בפרט, הם יכולים לשמש כדי לקבוע באופן אמין ובמהירות titers נוגדנים נגד וירוסים שונים אחרים עם יכולת hemagglutination, כגון חצבת, polyomaviruses, חזרת או אדמת14,15,16 .
כימות של קדם, פוסט-חיסון שפעת וירוס נוגדן ספציפי titers היא כלי חשוב הכרחי ללימודי חיסון. בהתבסס על האמצעים הפונדקאית של הגנה מפני הידבקות בווירוסים, כגון seroprotection (> 1:40) או seroconversion (כייל נוגדנים 4-fold עלייה), חיסון אסטרטגיות יכול להיות מותאם9. באמצעות פרוטוקולים שסופקו ניתן לקבוע: (i) ?…
The authors have nothing to disclose.
. לא-
25 ml Disposable Multichannel Pipette Reservoirs | Integra | 4312 | |
8-well PCR tubes | Brand GMBH | 781332 | For serum aliquots |
96-well microtiter plate, U-shaped | TPP | 92097 | For HI assay when using mammalian RBCs |
96-well microtiter plate, V-shaped | Corning Costar | 3897 | For HI assay when using avian RBCs |
Aqua ad iniect. Steril | Bichsel AG | 1000004 | For preparing influenza antigen and cholera filtrate solutions |
Chicken RBC (10%) | Cedarlane | CLC8800 | 10% suspension of chicken red blood cells in Alsever's solution |
Cholera filtrate | Sigma-Aldrich | C8772 | Used as receptor destroying enzyme (RDE) |
Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | For diluting the serum samples, RBCs and antigens |
Eppendorf Multichannel pipette, 12-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683949 | |
Eppendorf Multichannel pipette, 8-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683930 | |
Guinea Pig RBC (10%) | Cedarlane | CLC1800 | 10% suspension of guinea pig red blood cells in Alsever's solution |
Influenza Anti-A/California/7/09 HA serum | NIBSC | 14/134 | Used as positive control at the HI assay |
Influenza Anti-A/Switzerland/9715293/2013-like HA serum | NIBSC | 14/272 | Used as positive control at the HI assay |
Influenza Anti-A/Texas/50/2012-Like HA Serum | NIBSC | 13/178 | Used as positive control at the HI assay |
Influenza Anti-B/Brisbane/60/2008-HA serum | NIBSC | 13/254 | Used as positive control at the HI assay |
Influenza Anti-B/Massachusetts/02/2012 HA serum | NIBSC | 13/182 | Used as positive control at the HI assay |
Influenza antigen A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) | NIBSC | 12/168 | Inactivated, partially purified A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) virus (ca. 46µgHA/ml) |
Influenza antigen A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) | NIBSC | 14/254 | Inactivated, partially purified A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) virus (ca. 55µgHA/ml) |
Influenza antigen A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) | NIBSC | 13/112 | Inactivated, partially purified A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) virus (ca. 74µgHA/ml) |
Influenza antigen B/Brisbane/60/2008 | NIBSC | 13/234 | Inactivated, partially purified B/Brisbane/60/2008 virus (ca. 42µgHA/ml) |
Influenza antigen B/Massachusetts/02/2012 | NIBSC | 13/134 | Inactivated, partially purified B/Massachusetts/02/2012 virus (ca. 35µgHA/ml) |
Serum-Tubes | S-Monovette, Sardstedt | 01.1601.100 | For serum extraction with clotting activator |
Single Donor Human RBC, Type 0 | Innovative Research | IPLA-WB3 | Suspension of single donor human red blood cells in Alsever's solution (ca. 26%) |
Turkey RBC (10%) | Cedarlane | CLC1180 | 10% suspension of turkey red blood cells in Alsever's solution |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco |