インフルエンザ特異抗体価を定量化する最適化された赤血球凝集抑制 (HI) 試験
Summary
示されたプロトコルでは、インフルエンザ ワクチン接種者の血清サンプルからインフルエンザ特異抗体価を定量化する赤血球凝集抑制法を実行する方法について説明します。最初のアッセイは、凝集によって最適なウイルス抗原濃度を決定します。2 番目の分析は, 血球凝集抑制によるインフルエンザ特異抗体価を定量化します。
Abstract
抗体は、インフルエンザや他の病原体に対する血清学的保護のサロゲート マーカーとして使用されます。ワクチンによる免疫を理解する前と後のワクチン接種の抗体の生産の詳細な知識が必要です。この資料では、特定のインフルエンザ抗体価を決定するための信頼性の高いポイントによってプロトコルについて説明します。最初のプロトコルでは、赤血球凝集は、2 番目のプロトコル (赤血球凝集アッセイ、HA アッセイ) その後の使用のための集中を標準化するのに必要な抗原量を指定する方法について説明します。2 番目のプロトコルでは、ひと血清・細胞培養上清 (赤血球凝集抑制法、HI 試験) のシリアル希薄を使用して異なるウイルス株インフルエンザ特異抗体価の定量について説明します。
応用例として 3 価不活化インフルエンザ ワクチンを受けた健康コホートの抗体応答を示す.また、インフルエンザ ウイルスと交差反応を示す、さまざまな種類の動物の赤い血球 (赤血球) を使用して、交差反応を最小限に抑える方法を説明しました。議論は、長所と短所提示法の特定のインフルエンザ抗体価の定量免疫のワクチン関連の理解を改善する方法を強調表示します。
Introduction
インフルエンザ ウイルスによる感染症は、かなりの罹患率、死亡率と高い医療費1,2,3,4に関連付けられます。特に、高齢者、新生児、妊婦、慢性疾患患者より重篤な臨床転帰のリスクです。したがって、循環のインフルエンザ ウイルスに対するワクチン接種ハイリスク集団のこれらの疾患の負担を減少する主な尺度であります。予防接種、例えば、保護しきい値を超えるインフルエンザ特異的抗体の後個々 の免疫応答の増加人口内のウイルスの伝達の可能性感染症と一般的に個々 のリスクが軽減されます。5. ワクチン誘発される体液性免疫応答の別の集団と様々 な年齢グループ間で詳細な理解は重要な臨床質問6,7、8に答えるための重要な要素,9、よう: 一部の高齢患者はなぜ感染症前のワクチン接種にもかかわらずを持って?「良い」と「十分な」ワクチン誘発される保護とは何ですか。どのくらいの頻度ワクチンは保護抗体に到達する免疫抑制患者に適用されるべきですか。最も効果的な投与量とは何ですか。ワクチン接種後の抗体価と新規アジュバントの影響は?ワクチンの抗体産生の測定は、これらの重要な質問に答えるし、予防接種の成果を向上させるに役立つことがあります。
ウイルス特異抗体価の定量は、様々 な免疫学的方法で実行できます。これには、固相10や中和の試金13ビーズに基づく ELISA11試金こんにちは試金12が含まれます。ELISA 法は、様々 な抗原に対する血清の比較的大量のスクリーニングを許可します。また、病原体特定免疫グロブリン (Ig) M および IgG 個別に検討します。抗原、例えば、直線のアミノ酸シーケンスまたはウイルスのような粒子の特性は、抗体の結合に影響を与える可能性があります潜在的なエピトープのスペクトラムは非常に広いと抗体かどうかに関する情報を提供しませんレスポンスは、機能的関連性です。
対照的に、中和法は、機能的細胞の感染を阻害する抗体の可能性を決定し、したがって潜在的な中和が反映されます。ただし、このメソッドは非常に労働集約的、特定の培養細胞し、ウイルスをライブとしたがって、それは時間のかかる、高価なと特別な装置を必要とする必要があります。
この資料は、特定のインフルエンザ抗体価を定量化するこんにちは世界保健機構 WHO ベース プロトコル12ステップバイ ステップの説明します。赤血球凝集は赤血球の凝集につながるいくつかのウイルスの特徴的な効果です。患者血清をこの効果の抑制には、中和効果を反映する抑制性抗体濃度測定が可能します。
同時に複数のサンプルのより効率的な処理と必要な時間を短縮できるように WHO プロトコルのワークフローを変更しました。最初のプロトコルでは、特定のインフルエンザ抗原の凝集反応電位の決定について説明します。そうすることで、正しいインフルエンザ抗原濃度は 2 番目のプロトコルの決定されます。この部分は、血液の各バッチと同様、すべての新しいウイルスの抗原で繰り返す必要があります。
2 番目のプロトコルでは、特定のインフルエンザ抗体価の定量について説明します。示されたプロトコルはしかしインフルエンザ ウイルスとひと血清サンプルの調査用に最適化された、それはも刺激免疫細胞、例えば、ウイルス特異 B 細胞からマウス血清や細胞培養上清中の適用することができます。結果は、絶対測定抗体として算定できます。多くのワクチン研究の幾何平均抗体価と 95% 信頼区間はそれぞれの特定の人口のため表示されます。解釈、seroprotection またはセロコン バージョンは、特定のウイルス集団の感受性を記述するよく使用されます。Seroprotection は、4 倍以上の抗体価を高める 2 つの時間ポイント (ほとんどの一般的予防接種前および 30 日後予防接種を使用) の間の seroprotective 抗体の達成と、≥1:40、および陽転の力価として定義されます。
両方のプロトコルが使いやすいし、彼らの研究の質問の広い範囲に適応することができます。特に、確実かつ迅速を決定する使用できます赤血球凝集反応、麻疹や polyomaviruses、流行性耳下腺炎、風疹14,15,16 などの容量を持つ他の各種のウイルスに対する抗体価.
Protocol
Representative Results
Discussion
前と後のワクチン接種インフルエンザ ウイルス抗体価の定量化は、ワクチン研究に必要な重要なツールです。Seroprotection などのウイルス感染症に対する保護のサロゲートのメジャーに基づいて (> 1:40) またはセロコン バージョン (力価の 4 倍増)、予防接種戦略をすることができます最適化された9。指定されたプロトコルを使用して判断できます: (i) (ii) 興味のウイルス抗体?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
なし。
Materials
| 25 ml Disposable Multichannel Pipette Reservoirs | Integra | 4312 | |
| 8-well PCR tubes | Brand GMBH | 781332 | For serum aliquots |
| 96-well microtiter plate, U-shaped | TPP | 92097 | For HI assay when using mammalian RBCs |
| 96-well microtiter plate, V-shaped | Corning Costar | 3897 | For HI assay when using avian RBCs |
| Aqua ad iniect. Steril | Bichsel AG | 1000004 | For preparing influenza antigen and cholera filtrate solutions |
| Chicken RBC (10%) | Cedarlane | CLC8800 | 10% suspension of chicken red blood cells in Alsever's solution |
| Cholera filtrate | Sigma-Aldrich | C8772 | Used as receptor destroying enzyme (RDE) |
| Dulbecco's PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | For diluting the serum samples, RBCs and antigens |
| Eppendorf Multichannel pipette, 12-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683949 | |
| Eppendorf Multichannel pipette, 8-channel, 10-100 µl | Sigma-Aldrich | Z683930 | |
| Guinea Pig RBC (10%) | Cedarlane | CLC1800 | 10% suspension of guinea pig red blood cells in Alsever's solution |
| Influenza Anti-A/California/7/09 HA serum | NIBSC | 14/134 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Switzerland/9715293/2013-like HA serum | NIBSC | 14/272 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-A/Texas/50/2012-Like HA Serum | NIBSC | 13/178 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Brisbane/60/2008-HA serum | NIBSC | 13/254 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza Anti-B/Massachusetts/02/2012 HA serum | NIBSC | 13/182 | Used as positive control at the HI assay |
| Influenza antigen A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) | NIBSC | 12/168 | Inactivated, partially purified A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181) virus (ca. 46µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) | NIBSC | 14/254 | Inactivated, partially purified A/Switzerland/9715293/2013 (NIB88) virus (ca. 55µgHA/ml) |
| Influenza antigen A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) | NIBSC | 13/112 | Inactivated, partially purified A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) virus (ca. 74µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Brisbane/60/2008 | NIBSC | 13/234 | Inactivated, partially purified B/Brisbane/60/2008 virus (ca. 42µgHA/ml) |
| Influenza antigen B/Massachusetts/02/2012 | NIBSC | 13/134 | Inactivated, partially purified B/Massachusetts/02/2012 virus (ca. 35µgHA/ml) |
| Serum-Tubes | S-Monovette, Sardstedt | 01.1601.100 | For serum extraction with clotting activator |
| Single Donor Human RBC, Type 0 | Innovative Research | IPLA-WB3 | Suspension of single donor human red blood cells in Alsever's solution (ca. 26%) |
| Turkey RBC (10%) | Cedarlane | CLC1180 | 10% suspension of turkey red blood cells in Alsever's solution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco |
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