Enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent du cerveau post-mortem humain
Summary
Un protocole de fractionnement abrégée pour l’enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent du cerveau post-mortem humain est décrite.
Abstract
Dans cette étude, les auteurs décrivent un protocole abrégée seule étape fractionnement pour l’enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent du cerveau humain de post-mortem. Le détergent ionique N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) solubilise efficacement les protéines nativement repliées dans le tissu cérébral, ce qui permet l’enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent parmi un large éventail de proteinopathies neurodégénératives, telles que La maladie d’Alzheimer (ma), la maladie de Parkinson et la sclérose latérale amyotrophique et maladies à prions. Contrôle de l’homme et les tissus du cerveau post-mortem AD ont été homogénéisés et sédimentée par ultracentrifugation en présence de sarkosyl pour enrichir les agrégats de protéines insolubles dans un détergent dont la protéine tau phosphorylée pathologique, le composant principal d’enchevêtrements enchevêtrements dans AD. Western blot ont démontré la solubilité différentielle des agrégés-tau phosphorylée et la protéine soluble dans un détergent, Endosome précoce Antigen 1 (EEA1) dans le contrôle et le cerveau. Analyse protéomique a également révélé l’enrichissement des β-amyloïde (Aß), tau, snRNP70 (U1 – 70 K) et de l’apolipoprotéine E (APOE) dans les fractions sarkosyl insoluble du cerveau par rapport à celles du contrôle, compatible avec les stratégies précédentes de fractionnement tissulaire . Par conséquent, ce protocole simple enrichissement est idéal pour un large éventail d’applications expérimentales allant de Western Blot et protéine fonctionnelle épreuves agrégation Co à basé sur la spectrométrie de masse protéomique.
Introduction
Les maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer (ma), maladie de Parkinson (MP), maladie de Huntington (MH), sclérose latérale amyotrophique (SLA) et les maladies de prion étroitement apparentées sont proteinopathies caractérisée par l’accumulation progressive de agrégats de protéine insoluble dans le détergent dans le cerveau avec accompagnement cognitives déclinent. 1 , 2 cette caractéristique pathologique partagée est censée jouer un rôle central dans l’étiologie et la physiopathologie de ces maladies neurodégénératives. 2 ces agrégats sont composés de polymères fibres amyloïdes, qui sont composées d’unités de protéines mal repliées montrant Croix βrépétitives-structure. 1 , 2 , 3 , 4 biochimiquement, agrégats amyloïdes sont très résistants à la dénaturation chimique ou thermique et solubilisation,3 qui présente des difficultés particulières pour leur purification, analyse et étudient via des techniques biochimiques classiques. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 sans surprise, la fraction des protéines insolubles dans un détergent a fait l’objet de nombreuses recherches dans la physiopathologie des maladies neurodégénératives impliquant l’accumulation de protéines mal repliées. 6 , 12 , 13 , 14
Les techniques de fractionnement biochimique ont souvent été utilisés pour enrichir la fraction insoluble dans le détergent d’homogénats de cerveau post-mortem. 6 , 12 , 13 , 14 une des méthodes plus courantes consiste à l’extraction séquentielle des homogénats de tissus avec des tampons et des détergents d’accroître la rigueur, suivi par ultracentrifugation pour partitionner les fractions solubles et insolubles. Un fractionnement séquentiel couramment utilisés protocole6,14 implique l’homogénéisation des échantillons de tissus congelés dans un tampon sans tensioactifs hyposodé (LS) et les pellets insolubles qui en résultent sont extraites puis séquentiellement avec tampons contenant du sel élevé, détergents non ioniques, saccharose élevé, détergents ioniques et enfin chaotropes comme urée. 6 , 14 un inconvénient évident de ces protocoles de fractionnement séquentiel un est beaucoup de temps et engagement de travail nécessaire pour les terminer. Y compris l’homogénéisation et l’ultracentrifugation, un protocole typique cinq étapes fractionnement peut prendre plusieurs heures, voire jours pour compléter. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 en outre, agrégats de protéine pathologique autant restent insolubles dans tous, mais les plus dures conditions19,20 la plupart des fractions générées sont d’une utilité limitée. Ainsi, les mesures moins rigoureuses fractionnement utilisant de fortes concentrations en sel et détergents non ioniques sont largement redondants.
Des études antérieures ont montré que le détergent ionique N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) est un excellent candidat pour un protocole simplifié seule étape détergent fractionnement. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 comme un détergent dénaturation, sarkosyl est suffisamment strict pour solubiliser la grande majorité des protéines nativement repliées dans le cerveau sans la solubilisation des agrégats de protéines mal repliées composés de protéine bêta-amyloïde (Aß),6,11 tau phosphorylée (pTau),6 protéines de liaison à l’ADN de goudron 43 (TDP-43),14 alpha-synucléine, tremblante de12,13 ,23 ou U1 petites ribonucléoprotéines nucléaires (snRNP U1) tels que U1 – 70 K. 5 , 21 , 22 Sarkosyl étant moins rigoureux que le dodécylsulfate de sodium de détergent anionique omniprésent (SDS), elle conserve moins robustes formes oligomères d’agrégats de protéines mal repliées qui ne peut pas résister aux traitement de SDS. 9
Auparavant, nous avons décrit un protocole de détergent-fractionnement abrégé qui a obtenu des résultats comparables aux méthodes de fractionnement séquentiel plus laborieux. 5 en omettant les étapes de fractionnement moins rigoureux, nous avons pu développer un protocole facile seule étape fractionnement pour l’enrichissement des agrégats de protéine insoluble dans le détergent du cerveau humain post-mortem. 5 ce protocole détaillé décrit ci-après est bien adapté pour un large éventail d’applications expérimentales allant de Western Blot et basé sur la spectrométrie de masse protéomique fonctionnelle repliement et ensemencement d’agrégation des analyses. 5 , 6 , 21
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans les présentes, nous introduisons et discuter d’un protocole de détergent-fractionnement seule étape abrégé qui s’applique à un large éventail d’applications expérimentales allant d’analyse basé sur la spectrométrie de masse protéomique d’une protéine fonctionnelle mauvais repliement des essais et transfert Western. 5 , 6 , 7 , 10 cette méthodologie est peut-être plu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient les Drs Jim Lah et Allan Levey, département de neurologie de Emory, des suggestions et des commentaires utiles. Ce travail a été en partie financé par le partenariat de médecine accélérant (U01AG046161-02), le Emory Alzheimer de grant Disease Research Center (P50AG025688) et un National Institute on Aging accordent (R01AG053960-01) à SNRC Cette recherche a été également soutenue en partie par le noyau de neuropathologie de l’octroi d’installations centrales de Emory Neuroscience NINDS, P30NS055077.
Materials
| Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) | Thermo Fisher | 78441 | protease & phosphatase inhibitor cocktail |
| Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) | Fisher Scientific | FB505110 | microtip ultrasonicator |
| Optimax TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361545 | refrigerated ultracentrifuge |
| TLA120.1 rotor | Beckman Coulter | 362224 | ultracentrifuge rotor |
| 500 ul (8x34mm) polycarbonate tubes, thickwall | Beckman Coulter | 343776 | ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor |
| 4X SDS sample buffer | Home-made | N/A | SDS-PAGE |
| TCEP solution, neutral pH | Thermo Fisher | 77720 | reducing agent |
| (TBS) blocking buffer | Thermo Fisher | 37542 | blocking buffer |
| (TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | blocking buffer and antibody diluent |
| 4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well | Thermo Fisher | NW04120BOX | precast SDS-PAGE gels |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher | B0002 | SDS-PAGE running buffer |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma Aldrich | L5777-50G | detergent |
| 1.5 ml polypropylene Pellet Pestle | Kimble Chase | 749521-1500 | homogenization tool |
| cordless motor for Pellet Pestle | Kimble Chase | 749540-0000 | homogenization tool |
| Anti-Tau-2 (pan tau) antibody | Chemicon | MAB375 | antibodies |
| Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody | Millipore | MAB5450 | antibodies |
| Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) | Thermo Fisher | MN1020 | antibodies |
| Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody | abcam | ab2900 | antibodies |
| Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A21058 | antibodies |
| Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A11374 | antibodies |
| iBlot2 Dry Blotting System | Thermo Fisher | IB21001 | Gel transfer |
| iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini | Thermo Fisher | IB23002 | Gel transfer |
References
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991 (1991).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
- Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
- Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist’s Perspective. Role in Alzheimer’s and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
- Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
- Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer’s Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
- Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer’s Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
- Julien, C., Bretteville, A., Planel, E., Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. . Amyloid Proteins: Methods and Protocols. , 473-491 (2012).
- Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).
- Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
- Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. FASEB J. , (2005).
- Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
- Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130 (2006).
- Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
- Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer’s β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
- Yang, L. -. S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer’s disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).
- Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
- Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer’s Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer’s disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer’s brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
- Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer’s disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).
