인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축

Summary

인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축에 대 한 약식된 분류 프로토콜 설명 되어 있습니다.

Abstract

이 연구에서 우리는 인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축에 대 한 약식된 단일 단계 분류 프로토콜을 설명합니다. 이오니아 세제 N-라우릴-sarcosine (sarkosyl)는 효과적으로 뇌 조직 신경 proteinopathies의 넓은 범위에서 세제 불용 성 단백질의 농축을 같이 허용에 기본적으로 접힌된 단백질 solubilizes Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 및 루 경화 증, 그리고 프리온 질병 인간의 제어 및 광고 사후 뇌 조직 되었고 무 균 sedimented ultracentrifugation sarkosyl 세제 불용 성 단백질 집계 pathologic phosphorylated 타우, neurofibrillary의 핵심 구성 요소를 포함 하 여 풍부 하 게 존재 하 여 광고에 tangles입니다. 서 부 럽 집계 phosphorylated 타우와 세제 수용 성 단백질, 제어 및 광고 두뇌에서 초기 Endosome 항 원 1 (EEA1)의 차동 가용성을 설명 했다. Proteomic 분석은 또한 β의 농축을 밝혀-아 밀 로이드 (Aβ), 타우, snRNP70 (U1-70 K), 그리고 apolipoprotein E (APOE) 제어, 이전 조직 분류 전략 일치의 그들에 비교 하는 광고 두뇌의 sarkosyl-불용 성 분수에 . 따라서,이 간단한 농축 프로토콜에 이르기까지 서 부 럽 고 기능 단백질에서 공동 집계 분석 실험 단백질 질량 분석 기반 실험 응용 프로그램의 광범위 한 이상적입니다.

Introduction

Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 루 경화 증 (ALS), 밀접 하 게 관련된 프리온 질환 등 신경 퇴행 성 질환은 proteinopathies의 점진적인 축적에 의해 특징 세제 불용 성 단백질 집계 동반 인지 뇌에서 떨어진다. ^{1 , 2} 이 공유 병 적인 기능 이상 이러한 신경 퇴행 성 질환의 병 인에 중심 역할을 담당할 생각 이다. ² 이러한 집계 일반적으로 β크로스 misfolded 단백질 전시의 단위를 반복으로 구성 된 고분자 녹말 체 섬유의 구성-구조. ^{1 , 2 , 3 , 4} 화학적, 녹말 체 집계는 화학 또는 열 변성을 가용 화, 그들의 정화, 분석에 독특한 도전을 선물 한다³ 높은 저항 하 고 전통적인 생 화 확 적인 기술을 통해 공부. ^{2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11} unsurprisingly, 세제 불용 성 단백질 분수가 되었습니다 misfolded 단백질의 축적을 포함 하는 신경 퇴행 성 질환의 이상으로 많은 연구의 초점. ^{6 , 12 , 13 , 14}

생 화 확 적인 분류 기법 종종 사후 뇌 homogenates에서 세제 불용 성 부분을 풍부 하 게 이용 되어 있다. ^{6 , 12 , 13 , 14} 가장 일반적인 방법 중 하나는 버퍼와 조직 homogenates의 연속 추출과 엄중, 가용성과 불용 성 부분을 분할 하는 ultracentrifugation 다음 증가의 세제 포함 됩니다. 일반적으로 사용 되는 순차 분류 프로토콜^6,14 세제 무료 낮은 소금 (LS) 버퍼에서 냉동된 조직 샘플의 균질 화를 포함 하 고 결과 불용 성 펠 릿은 다음 순차적으로 추출 높은 소금, 비 이온 세제, 높은 자당을 포함 하는 버퍼, 이온 세제 그리고 마지막으로 chaotropes 요소 처럼. ^{6 , 14} 이러한 순차적 분별 프로토콜의 명백한 결점은 상당한 시간과 노동 투입을 완료 하는 데 필요한. 균질과 ultracentrifugation를 포함 하 여 전형적인 5 단계 분류 프로토콜 걸릴 수 있습니다 몇 시간 또는 일. ^{4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18} 또한, 많은 pathologic 단백질 집계 남아 모든 가혹한 조건^19,20 하지만 불용 성 생성 된 분수의 대부분은 제한 된 값의. 따라서, 높은 소금 농도 및 비 이온 세제 덜 엄격한 분류 단계 크게 중복 됩니다.

이전 연구는 이온 세제 N-라우릴-sarcosine (sarkosyl)는 단순화 된 단일 단계 세제 분별 프로토콜에 대 한 우수한 후보 나타났습니다. ^{5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23} 변성 세제로 sarkosyl는 충분히 solubilizing misfolded 단백질 집계 베타-아 밀 로이드 (Aβ),^{6,11의 구성 없이 뇌에서 기본적으로 접힌된 단백질의 대부분을 solubilize 엄격한} phosphorylated 타우 (pTau),⁶ 타르 DNA 묶는 단백질 43 (TDP-43),¹⁴ 알파 synuclein,^12,13 scrapie,²³ 또는 u 1 작은 핵 ribonucleoproteins (U1 snRNPs) u 1-70 K 등. ^{5 , 21 , 22} Sarkosyl 유비 쿼터 스 음이온 세제 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 보다 덜 엄격으로, SDS 처리를 견딜 수 없는 misfolded 단백질 집계의 덜 강력한 oligomeric 형태 유지 합니다. ⁹

이전에 우리는 더 힘 드는 순차 분류 방법론에 유사한 결과 달성 하는 약식된 세제 분별 프로토콜을 설명 합니다. ⁵ 덜 엄격한 분류 단계를 생략 하 여 우리 수 있었다 사후 인간의 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축에 대 한 손쉬운 단일 단계 분류 프로토콜을 개발. ⁵ 여기에 설명 된이 상세한 프로토콜 서쪽에 게 더 럽 히기에서 배열 하는 실험적인 응용 프로그램의 광범위 한 적합 하 고 기능적인 단백질 misfolding 및 집계 시드를 질량 분석 기반 단백질 분석 실험. ^{5 , 6 , 21}

Protocol

윤리 성명: 모든 뇌 조직에 모리 츠에서 가져온 ' s 질환 연구 센터 (ADRC) 두뇌 은행. 인간의 사후 조직 적절 한 제도적 검토 위원회 (IRB) 프로토콜에서 인수 했다. 1. 균질 및 분류 조직 선택 참고: 사후 담당 조직에서 건강 한 제어 (Ctl) 및 병 적 고정 광고 사례를 확인된은 모리에서 선정 되었다 ADRC 두뇌 은행 (n = 2). 녹말 체 패 배포의 사후 neuro…

Representative Results

축약된 한 단계 sarkosyl-분별 프로토콜 제어 및 광고 사후 뇌 (그림 1)에서 세제 불용 성 단백질 집계를 풍부 하 게 사용 되었다. TH-S, S1, S2, P2 분수에서 단백질 SDS-PAGE, Coomassie 파란 통 버퍼 Coomassie 화려한 블루 G-250 얼룩 버퍼와 부드러운 얼룩 뒤에 15 분에 대 한 고정 해결 했다. 때문에 s 2 분수에 단백질의 탐지 수준 물의 resuspension 단계는 선택 사항 (1.1.1…

Discussion

여기 소개 하 고 다양 한 misfolding 분석 기능 단백질 질량 분석 기반 proteomics 분석에서까지 실험적인 응용 프로그램에 적용 하는 약식된 단일 단계 세제 분별 프로토콜 토론 그리고 서 부 럽입니다. ^{5 , 6 , 7 , 10} 이 방법론은 아마도 가장 효과적인 치 매 등 신경 proteinopathies 공부 하는 데 사용 하는 경우, ?…

Materials

Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X)	Thermo Fisher	78441	protease & phosphatase inhibitor cocktail
Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)	Fisher Scientific	FB505110	microtip ultrasonicator
Optimax TLX Ultracentrifuge	Beckman Coulter	361545	refrigerated ultracentrifuge
TLA120.1 rotor	Beckman Coulter	362224	ultracentrifuge rotor
500 ul (8x34mm) polycarbonate tubes, thickwall	Beckman Coulter	343776	ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor
4X SDS sample buffer	Home-made	N/A	SDS-PAGE
TCEP solution, neutral pH	Thermo Fisher	77720	reducing agent
(TBS) blocking buffer	Thermo Fisher	37542	blocking buffer
(TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20	Thermo Fisher	37543	blocking buffer and antibody diluent
4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well	Thermo Fisher	NW04120BOX	precast SDS-PAGE gels
MES SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fisher	B0002	SDS-PAGE running buffer
N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)	Sigma Aldrich	L5777-50G	detergent
1.5 ml polypropylene Pellet Pestle	Kimble Chase	749521-1500	homogenization tool
cordless motor for Pellet Pestle	Kimble Chase	749540-0000	homogenization tool
Anti-Tau-2 (pan tau) antibody	Chemicon	MAB375	antibodies
Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody	Millipore	MAB5450	antibodies
Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8)	Thermo Fisher	MN1020	antibodies
Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody	abcam	ab2900	antibodies
Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	Thermo Fisher	A21058	antibodies
Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody	Thermo Fisher	A11374	antibodies
iBlot2 Dry Blotting System	Thermo Fisher	IB21001	Gel transfer
iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini	Thermo Fisher	IB23002	Gel transfer