Echocardiographic en histologisch onderzoek van cardiale morfologie in de muis
Summary
Echocardiographic onderzoek wordt vaak gebruikt in muizen. Dure high-resolution echografie apparaten zijn ontwikkeld voor dit doel. Dit protocol beschrijft een betaalbare echocardiographic procedure gecombineerd met histologische Morfometrische analyses om te bepalen van cardiale morfologie.
Abstract
Een toenemend aantal genetisch gemodificeerde Muismodellen beschikbaar zijn gekomen in de afgelopen jaren. Bovendien is het aantal farmacologische studies uitgevoerd bij muizen is hoog. Fenotypische karakterisering van deze Muismodellen vereist ook het onderzoek van de hartfunctie en morfologie. Echocardiografie en magnetische resonantie beeldvorming (MRI) zijn veelgebruikte benaderingen voor het karakteriseren van de hartfunctie en morfologie in muizen. Echocardiographic en MRI apparatuur gespecialiseerd voor gebruik in kleine knaagdieren duur is en een speciale ruimte vereist. Dit protocol beschrijft cardiale metingen bij muizen met behulp van een klinische echocardiographic systeem met een menselijke vasculaire sonde 15 MHz. De metingen zijn verricht op narcose volwassen muizen. Ten minste drie afbeeldingsreeksen worden geregistreerd en geanalyseerd voor elk dier in M-modus in de weergave van de korte-as parasternal. Daarna, cardiale histopathologisch onderzoek is verricht, en cardiomyocyte diameters worden bepaald op de Haematoxyline-eosine- of tarwekiemen agglutinin (WGA)-gekleurd paraffine secties. Vaartuig dichtheid is vastbesloten morphometrically na Pecam-1 immunokleuring. Het protocol is met succes toegepast op farmacologische studies en verschillende genetische diermodellen onder uitgangssituatie, alsmede na experimentele myocardinfarct door de permanente Afbinding van de linker anterior aflopende coronaire ( LAD). In onze ervaring, echocardiographic onderzoek is beperkt tot narcose dieren en is haalbaar in volwassen muizen met een gewicht van ten minste 25 g.
Introduction
Een groot aantal genetisch gemodificeerde Muismodellen zijn beschikbaar, en het aantal farmacologische studies in muizen is hoog1,2. Echocardiografie en MRI zijn veelgebruikte benaderingen voor de fenotypische karakterisering van hartfunctie en morfologie bij deze muis modellen3. Het doel van het voorgestelde protocol is hartfunctie en morfologie in volwassen muizen te analyseren. Het combineert echocardiographic, histologisch, en immunohistochemische metingen. Echocardiographic onderzoek wordt wijd gebruikt in muizen4,5,6,7,8,9,10,11, 12. Pachon et al. 11 205 studies gepubliceerd in omloop, Omloop onderzoek, American Journal of Physiology – hart en bloedsomloop fysiologieen Cardiovasculair onderzoek tussen 2012 en 2015 die geïdentificeerd gebruikt echocardiographic onderzoek bij dieren.
Echocardiografie wordt gebruikt ter identificatie van de cardiale fenotypen in genetisch gemodificeerde muizen5,6,13,14,15,16, 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22, evenals over het analyseren van de hartfunctie in chronische overbelasting-geïnduceerde hypertrofie, myocardiale ischemie en cardiomyopathie modellen in muizen (herzien in12). Verbeterde echocardiografie apparatuur staat voor de de standaard maat van links-ventriculaire (LV) systolische en diastolische afmetingen, weefsel Doppler imaging, myocardiale contrast echografie en de beoordeling van de regionale functie LV en coronaire reserve 12. idealiter echocardiographic onderzoek moet worden verricht in de bewuste muizen om te voorkomen dat de negatieve effecten van de narcose op de contractiele functie, autonome reflex controle, en hart tarief11. Echter, deze aanpak wordt beperkt door de eis om te trainen van de dieren; moeilijkheden bij het houden van de lichaamstemperatuur stabiel; bewegingsartefacten; stress; zeer hoge cardiale frequenties; en de eis van ten minste twee onderzoekers voor het uitvoeren van het experiment, vooral als een groot aantal dieren onderzocht worden. Interessant, rapporteerde een recente studie geen verschillen in echocardiographic parameters in getrainde en ongetrainde dieren19. Wij voeren echocardiographic metingen in narcose muizen. Verschillende verdoving protocollen zullen hieronder worden besproken.
Hoewel standaardresolutie echocardiografie (> 10 MHz) is voldoende maatregel LV systolische en diastolische dimensies en hartfunctie bij volwassen muizen, de methode is beperkt in zijn beschrijving van de onderliggende structurele verschijnselen. Zo combineren we de metingen in vivo met histologische en immunohistological analyses te meten, bijvoorbeeld cardiomyocyte diameter en vaartuig dichtheid. Andere histologische en immunohistological onderzoeken, zoals de bepaling van de proliferatie, onderzoek van apoptosis, infarct grootte metingen, bepaling van fibrose, en specifieke marker expressie, kunnen ook worden uitgevoerd op hetzelfde type weefsel verwerkt, maar zijn niet het onderwerp van dit protocol. De combinatie van in vivo echocardiographic examen met histologische analyses biedt aanvullende inzichten in onderliggende structurele veranderingen. In een extra stap, kunnen we deze metingen met moleculaire en ultra structurele onderzoek voltooien. Histologische analyses niet alleen het echocardiographic onderzoek voltooien, maar ook onmisbaar geworden als de resolutie van echocardiografie niet voldoende is. Dit is vooral het geval in modellen van genetisch gemodificeerde muizen die embryonale dodelijke23,24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verschillende methoden hebben ontwikkeld om te evalueren van de cardiale structuur en functie in muizen, met inbegrip van echocardiografie, contrast-enhanced MRI, micro CT en PET-scan. Vanwege de kosteneffectiviteit en eenvoud is echocardiografie de meest gebruikte techniek voor functionele analyse in muizen11. In het algemeen, vanwege de kleine omvang van het hart en de hoge frequentie van de hartslag bij muizen, omvormers met een frequentie > 10 MHz moet worden gebruikt, hoewel succesvol met…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd gesteund door de Franse regering (National Research Agency, ANR) via het programma “Investeringen voor de toekomst” LABEX SIGNALIFE (referentie ANR-11-LABX-0028-01) en door subsidies aan K. D. W. van de Association pour la Recherche sur le Cancer, Fondation de France, en Plan kanker Inserm. D. B. en A. V. ontvangen beurzen van de Fondation pour la Recherche Médicale en van de stad van Nice, respectievelijk. De echocardiograph en de transducer waren vriendelijk geboden door Philips. Wij danken A. Borderie, S. Destree M. Cutajar-Bossert, A. Landouar, A. Martres, A. Biancardini en S. M. Wagner voor hun deskundige technische bijstand.
Materials
| Wheat germ agglutinin (WGA) conjugated tetramethylrhodamine | Life Technologies, Molecular Probes | W849 | |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vectorlabs | BA-1000 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vectorlabs | SP-2001 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Standard) | Vectorlabs | PK-6100 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4168 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | |
| Anti-Pecam-1 (CD31) antibody | Abcam | ab28364 | |
| Ultrasound transmission gel, Gel Aquasonic 100 | Parker | ||
| Linear ultrasound probe, L15-7io | Philips Healthcare | ||
| Echocardiograph, IE33 xMATRIX | Philips Healthcare | ||
| Microscope, Leica DMi8 | Leica | ||
| Fluorescence Filterset DAPI | Leica | 11525304 | |
| Filterset TxR | Leica | 11525310 | |
| Digital Camera, SPOT RT3 Color Slider | Spot Imaging | ||
| Imaging Software, SPOT 5.2 Advanced and Basic Software | Spot Imaging | ||
| Imaging Computer | Dell | ||
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Large Scissors | Fine Science Tools | 14501-14 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
| Rodent shaver | Harvard Apparatus | 34-0243 | |
| cassettes for paraffin embedding | Sakura | 4155F | |
| neutral buffered Formalin | Sakura | 8727 | |
| Xylene | Sakura | 8733 | |
| Paraffine TEK III | Sakura | 4511 | |
| automated embedding apparatus, Tissue-Tek VIP | Sakura | 6032 | |
| paraffin-embedding station Tissue-Tek TEC 5 | Sakura | 5229 | |
| microtome blades,Accu-Edge S35 | Sakura | 4685 | |
| microscopy slides, Tissue-Tek | Sakura | 9533 | |
| cover slips, Tissue-Tek | Sakura | 9582 | |
| Mounting medium Tissue-Tek | Sakura | 1408 | |
| slide boxes | Sakura | 3958 | |
| eosine solution | Sakura | 8703 | |
| hematoxyline solution | Sakura | 8711 | |
| microtome, RM2125RT | Leica | 720-1880 (VWR) | |
| water bath, Leica HI1210 | Leica | 720-0113(VWR) | |
| Ethanol | VWR | ACRO444220050 | |
| 15 ml tubes | VWR | 734-0451 | |
| staining glass dish | VWR | MARI4220004 | |
| staining jars | VWR | MARI4200005 | |
| Incubator | Binder | 9010-0012 | |
| DAB and urea hydrogen peroxide tablets, SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | |
| PBS (10X) | Thermo Fisher Scientific | 70011044 |
References
- Ormandy, E. H., Dale, J., Griffin, G. Genetic engineering of animals: ethical issues, including welfare concerns. Can Vet J. 52 (5), 544-550 (2011).
- Karl, T., Pabst, R., von Hörsten, S. Behavioral phenotyping of mice in pharmacological and toxicological research. Exp Toxicol Pathol. 55 (1), 69-83 (2003).
- Phoon, C. K., Turnbull, D. H. Cardiovascular Imaging in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 6 (1), 15-38 (2016).
- Wagner, N., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor beta stimulation induces rapid cardiac growth and angiogenesis via direct activation of calcineurin. Cardiovasc Res. 83 (1), 61-71 (2009).
- Wagner, K. D., Vukolic, A., Baudouy, D., Michiels, J. F., Wagner, N. Inducible Conditional Vascular-Specific Overexpression of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Beta/Delta Leads to Rapid Cardiac Hypertrophy. PPAR Res. 2016, 7631085 (2016).
- Ghanbarian, H., et al. Dnmt2/Trdmt1 as Mediator of RNA Polymerase II Transcriptional Activity in Cardiac Growth. PLoS One. 11 (6), e0156953 (2016).
- Meguro, T., et al. Cyclosporine attenuates pressure-overload hypertrophy in mice while enhancing susceptibility to decompensation and heart failure. Circ Res. 84 (6), 735-740 (1999).
- de Araújo, C. C., et al. Regular and moderate aerobic training before allergic asthma induction reduces lung inflammation and remodeling. Scand J Med Sci Sports. 26 (11), 1360-1372 (2016).
- Benavides-Vallve, C., et al. New strategies for echocardiographic evaluation of left ventricular function in a mouse model of long-term myocardial infarction. PLoS One. 7 (7), e41691 (2012).
- Colazzo, F., et al. Murine left atrium and left atrial appendage structure and function: echocardiographic and morphologic evaluation. PLoS One. 10 (4), e0125541 (2015).
- Pachon, R. E., Scharf, B. A., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Best anesthetics for assessing left ventricular systolic function by echocardiography in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308 (12), H1525-H1529 (2015).
- Gao, S., Ho, D., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Echocardiography in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 1, 71-83 (2011).
- Mor-Avi, V., et al. Current and evolving echocardiographic techniques for the quantitative evaluation of cardiac mechanics: ASE/EAE consensus statement on methodology and indications endorsed by the Japanese Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 24 (3), 277-313 (2011).
- Collins, K. A., Korcarz, C. E., Lang, R. M. Use of echocardiography for the phenotypic assessment of genetically altered mice. Physiol Genomics. 13 (3), 227-239 (2003).
- Rottman, J. N., Ni, G., Brown, M. Echocardiographic evaluation of ventricular function in mice. Echocardiography. 24 (1), 83-89 (2007).
- Hart, C. Y., Burnett, J. C., Redfield, M. M. Effects of avertin versus xylazine-ketamine anesthesia on cardiac function in normal mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (5), H1938-H1945 (2001).
- Moran, C. M., Thomson, A. J., Rog-Zielinska, E., Gray, G. A. High-resolution echocardiography in the assessment of cardiac physiology and disease in preclinical models. Exp Physiol. 98 (3), 629-644 (2013).
- Fayssoil, A., Tournoux, F. Analyzing left ventricular function in mice with Doppler echocardiography. Heart Fail Rev. 18 (4), 511-516 (2013).
- Schoensiegel, F., et al. High throughput echocardiography in conscious mice: training and primary screens. Ultraschall Med. 32, S124-S129 (2011).
- Yariswamy, M., et al. Cardiac-restricted Overexpression of TRAF3 Interacting Protein 2 (TRAF3IP2) Results in Spontaneous Development of Myocardial Hypertrophy, Fibrosis, and Dysfunction. J Biol Chem. 291 (37), 19425-19436 (2016).
- Jara, A., et al. Cardiac-Specific Disruption of GH Receptor Alters Glucose Homeostasis While Maintaining Normal Cardiac Performance in Adult Male Mice. Endocrinology. 157 (5), 1929-1941 (2016).
- Kerr, B. A., et al. Stability and function of adult vasculature is sustained by Akt/Jagged1 signalling axis in endothelium. Nat Commun. 7, 10960 (2016).
- Wagner, N., et al. Coronary vessel development requires activation of the TrkB neurotrophin receptor by the Wilms’ tumor transcription factor Wt1. Genes Dev. 19 (21), 2631-2642 (2005).
- Wagner, K. D., et al. The Wilms’ tumour suppressor Wt1 is a major regulator of tumour angiogenesis and progression. Nat Commun. 5, 5852 (2014).
- Yang, X. P., et al. Echocardiographic assessment of cardiac function in conscious and anesthetized mice. Am J Physiol. 277 (5 Pt 2), H1967-H1974 (1999).
- Rottman, J. N., et al. Temporal changes in ventricular function assessed echocardiographically in conscious and anesthetized mice. J Am Soc Echocardiogr. 16 (11), 1150-1157 (2003).
- Quiñones, M. A., et al. Recommendations for quantification of Doppler echocardiography: a report from the Doppler Quantification Task Force of the Nomenclature and Standards Committee of the American Society of Echocardiography. J Am Soc Echocardiogr. 15 (2), 167-184 (2002).
- van Laake, L. W., et al. Monitoring of cell therapy and assessment of cardiac function using magnetic resonance imaging in a mouse model of myocardial infarction. Nat Protoc. 2 (10), 2551-2567 (2007).
- Wagner, K. D., et al. The Wilms’ tumor suppressor Wt1 is expressed in the coronary vasculature after myocardial infarction. FASEB J. 16 (9), 1117-1119 (2002).
- Wagner, K. D., et al. RNA induction and inheritance of epigenetic cardiac hypertrophy in the mouse. Dev Cell. 14 (6), 962-969 (2008).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ruifrok, A. C., Johnston, D. A. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol. 23 (4), 291-299 (2001).
- Lazzeroni, D., Rimoldi, O., Camici, P. G. From Left Ventricular Hypertrophy to Dysfunction and Failure. Circ J. 80 (3), 555-564 (2016).
- Ismail, J. A., et al. Immunohistologic labeling of murine endothelium. Cardiovasc Pathol. 12 (2), 82-90 (2003).
- Benton, R. L., Maddie, M. A., Minnillo, D. R., Hagg, T., Whittemore, S. R. Griffonia simplicifolia isolectin B4 identifies a specific subpopulation of angiogenic blood vessels following contusive spinal cord injury in the adult mouse. J Comp Neurol. 507 (1), 1031-1052 (2008).
- Ayoub, A. E., Salm, A. K. Increased morphological diversity of microglia in the activated hypothalamic supraoptic nucleus. J Neurosci. 23 (21), 7759-7766 (2003).
- Maddox, D. E., Shibata, S., Goldstein, I. J. Stimulated macrophages express a new glycoprotein receptor reactive with Griffonia simplicifolia I-B4 isolectin. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (1), 166-170 (1982).
- dela Paz, N. G., D’Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell Tissue Res. 335 (1), 5-16 (2009).
