Analyse van de Gap Junction-afhankelijke Transfer van miRNA met 3D-FRAP Microscopy
Summary
Hier beschrijven we de toepassing van driedimensionale fluorescentie herstel na photobleaching (3D-FRAP) voor de analyse van de gap-junction-afhankelijke shuttling van miRNA. In tegenstelling tot veelgebruikte methoden, maakt 3D-FRAP het mogelijk om de intercellulaire overdracht van kleine RNA's in realtime te kwantificeren, met een hoge spatio-temporale resolutie.
Abstract
Kleine antisense RNA's, zoals miRNA en siRNA, spelen een belangrijke rol in cellulaire fysiologie en pathologie en kunnen bovendien gebruikt worden als therapeutische middelen bij de behandeling van verschillende aandoeningen. De ontwikkeling van nieuwe, innovatieve strategieën voor miRNA / siRNA therapie is gebaseerd op een uitgebreide kennis van de onderliggende mechanismen. Recente gegevens suggereren dat kleine RNA's tussen cellen worden uitgewisseld op een kloppende koppelingsafhankelijke wijze, waardoor genregulerende effecten in de ontvangercel worden geïnduceerd. Moleculaire biologische technieken en flow cytometrische analyse worden vaak gebruikt om de intercellulaire uitwisseling van miRNA te bestuderen. Deze methoden bieden echter geen hoge temporale resolutie, die nodig is bij het bestuderen van de kloofverbindingsflux van moleculen. Daarom, om de impact van miRNA / siRNA als intercellulaire signaalmoleculen te onderzoeken, zijn er nieuwe tools nodig die de analyse van deze kleine RNA's op het cellulaire niveau mogelijk maken. Het onderhavige protocol beschrijft de apPlicatie van driedimensionale fluorescentieherstel na photobleaching (3D-FRAP) microscopie om de kloofverbinding-afhankelijke uitwisseling van miRNA moleculen tussen hartcellen te verduidelijken. Belangrijk is dat deze eenvoudige en niet-invasieve live-cel beeldvorming benadering het visualiseren en kwantificeren van de gap junctionele shuttling van fluorescent gelabelde kleine RNA's in real time, met een hoge spatio-temporale resolutie. De gegevens verkregen door 3D-FRAP bevestigen een nieuwe route van intercellulaire genregulatie, waarbij kleine RNA's fungeren als signaalmoleculen in het intercellulaire netwerk.
Introduction
Kleine niet-codering-RNA's zijn belangrijke spelers in cellulaire genregulatie. Deze moleculen zijn samengesteld uit 20-25 nucleotiden die binden aan een specifiek doelmRNA, wat leidt tot de blokkering van de translatie of tot mRNA-afbraak 1 , 2 . Het genregulerende proces dat wordt uitgevoerd door kleine RNA's, zoals miRNA en siRNA, is een zeer geconserveerd mechanisme dat in veel verschillende soorten 3 is gevonden. In het bijzonder zijn miRNA moleculen van cruciaal belang voor een verscheidenheid aan fysiologische processen, waaronder proliferatie, differentiatie en regeneratie 4 , 5 . Daarnaast wordt de dysregulatie van miRNA expressie toegeschreven aan veel pathologische aandoeningen. Overeenkomstig is aangetoond dat miRNAs geschikt zijn als biomarkers voor diagnose en als therapeutische middelen voor gentherapie 6 , 7 </sup>.
Gap junctions (GJs) zijn gespecialiseerde eiwitstructuren in het plasmamembraan van twee aangrenzende cellen die de diffusieuitwisseling van moleculen met een molecuulgewicht van tot 1 kD mogelijk maken. Ze zijn aangetoond dat ze belangrijk zijn voor weefselontwikkeling, differentiatie, celdood en pathologische stoornissen zoals kanker of hart- en vaatziekten 8 , 9 , 10 . Verscheidene moleculen zijn beschreven om GJ kanalen te kunnen overschrijden, met inbegrip van ionen, metabolieten en nucleotiden. Interessant, werden ook GJs gevonden om een weg te geven voor de intercellulaire beweging van kleine RNA's 11 , 12 . Zo kunnen miRNAs niet alleen handelen in de cel waarin ze worden geproduceerd, maar ook binnen de ontvanger cellen. Dit wijst op de rol van miRNAs in het intercellulaire signaaltransductiesysteem. Tegelijkertijd tonen de gegevens aanDie kloof intercellulaire communicatie is nauw verbonden met de miRNA functie. Door de significante invloed van miRNA en GJ's op homeostase, pathologie en diagnose van het weefsel, zal een uitgebreid begrip van de functie van GJ's en de daarmee verband houdende intercellulaire dynamiek van miRNA de mechanismen van miRNA-gebaseerde aandoeningen verduidelijken en nieuwe strategieën ontwikkelen voor MiRNA therapieën.
Afhankelijk van de mate van gap junctionele koppeling kan de overdracht van miRNA moleculen tussen cellen een zeer snel proces zijn. Daarom is een methodologie die het visualiseren en kwantificeren van de snelle intercellulaire beweging van deze regulerende signaalmoleculen mogelijk maakt. In het algemeen zijn stromingscytometrie en moleculaire biologische technieken toegepast om de shuttling van kleine RNA's 11 , 12 , 13 , 14 aan te tonen . Echter, in tegenstelling tot FRAP microsKopiëren, deze benaderingen ontbreken hoge temporale resolutie, die verplicht is bij het analyseren van de uitwisseling van miRNA via GJs. Bovendien is FRAP microscopie minder invasieve en vertegenwoordigt daarom een krachtige en nieuwe live-cell imaging techniek om de GJ-afhankelijke uitwisseling van moleculen in verschillende celtypen 15 , 16 , 17 te evalueren.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol waarin de toepassing van 3D-FRAP wordt beschreven om miRNA shuttling tussen cardiomyocyten te beoordelen. Hiervoor werden cardiomyocyten getransfecteerd met fluorescent gelabelde miRNA. Een cel gemarkeerd met dit miRNA werd gefabriceerd, en de gap-junctionele miRNA re-instroom van aangrenzende cellen werd op tijdsafhankelijke wijze geregistreerd. De hoge temporale resolutie van FRAP-experimenten biedt de mogelijkheid kinetische studies uit te voeren voor de nauwkeurige evaluatie van de intercellulaire overdracht van miRNA en siRNA tussen levende cellen. MoreoVer, omdat kleine RNA's kunnen worden uitgewisseld via verschillende mechanismen met zeer verschillende kinetica, kan FRAP-microscopie bijdragen tot het verduidelijken van de mate waarin GJ's betrokken zijn bij de respectieve shuttling-processen 18 . Daarnaast kan 3D-FRAP worden gebruikt om fysiologische en pathologische veranderingen in GJ permeabiliteit te onderzoeken en de invloed ervan op kleine RNA transfer 15 , 19 .
Protocol
Representative Results
Discussion
MiRNAs zijn belangrijke spelers in cellulaire fysiologie en werden aangetoond als signaalmoleculen door gebruik te maken van oa-GJs als een weg voor intercellulaire uitwisseling 11 , 12 , 22 . Het huidige protocol presenteert een in vitro levende cel imaging techniek om deze GJ-afhankelijke shuttling te karakteriseren met behulp van fluorescerende miRNAs in celclusters.
Het protocol w…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het ministerie van Onderwijs en Onderzoek Duitsland (FKZ 0312138A en FKZ 316159), de staat Mecklenburg-Voor-Pommeren met EU-structuurfondsen (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 en ESF / IVBM-B35-0010 / 12), de DFG (DA1296-1) en de German Heart Foundation (F / 01/12). Daarnaast wordt RD ondersteund door het FORUN-programma van Rostock University Medical Center (889001), de DAMP Foundation en de BMBF (VIP + 00240).
Materials
| neonatal NMRI mice | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/ml, 100µg/ml |
| Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Cell culture plastic | TPP | ||
| Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
| Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
| 4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
| Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
| goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
| goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250nM |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
References
- Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Grimm, D. Small silencing RNAs: state-of-the-art. Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).
- Raghunathan, S., Patel, B. M. Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases. Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).
- Sluijter, J. P. G. MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation. ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).
- Li, M., Zhang, J. Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases. Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
- Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians. Heart. 101 (12), 921-928 (2015).
- Maes, M., Crespo Yanguas, ., Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).
- Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. Role of connexin 43 in cardiovascular diseases. Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).
- Naus, C. C., Laird, D. W. Implications and challenges of connexin connections to cancer. Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).
- Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA. Oncotarget. 6 (17), 15566-15577 (2015).
- Lee, H. K. H., et al. Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal. Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).
- Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. Functional microRNA is transferred between glioma cells. Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).
- Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -. B. Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication. Sci Rep. 6, 19884 (2016).
- Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30. Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).
- Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching. J Biomed Opt. 19 (1), 15001 (2013).
- Lemcke, H., Nittel, M. -. L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression. Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).
- Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Gap junctional shuttling of miRNA – A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application. Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).
- Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells. Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).
- Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).
- Laupheimer, M., et al. Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient. Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).
- Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells. J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).
- Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Math Biosci. 280, 50-61 (2016).
- Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).
- Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins. J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).
- Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).
- Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis. Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).
- Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 8 (1), 166 (2007).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun. 2, 282 (2011).
- Squadrito, M. L., et al. Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells. Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).
- Zhang, B., Farwell, M. A. microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy. J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).
- Chen, Y., Gao, D. -. Y., Huang, L. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies. Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).
