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Bioengineering

Hydrogel पर जैव सक्रिय प्रोटीन या पेप्टाइड्स पैटर्न जैविक अनुप्रयोगों के लिए Photochemistry का उपयोग

Published: September 15, 2017 doi: 10.3791/55873
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 4, 4, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute, 2Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies, Rensselaer Polytechnic Institute, 3Department of Bioengineering, Northeastern University, 4Department of Bioengineering, University of Texas at Arlington

Summary

इस विधि में, हम photopolymerization और क्लिक करें रसायन विज्ञान तकनीकों का उपयोग पॉलीथीन की सतह पर प्रोटीन या पेप्टाइड पैटर्न बनाने के लिए ग्लाइकोल (खूंटी) hydrogels, सेलुलर प्रतिक्रियाओं के अध्ययन के लिए मैटीरियल सक्रिय संकेतों प्रदान इन विट्रो में .

Abstract

कई जैविक उत्तेजनाओं कि सेल व्यवहार और स्टेम सेल भेदभाव को प्रभावित कर सकते हैं । सामान्य कक्ष संस्कृति दृष्टिकोण कक्ष व्यवहार को नियंत्रित करने के लिए माध्यम के भीतर घुलनशील कारकों पर निर्भर करते हैं । हालांकि, घुलनशील जोड़ कुछ संकेतन रूपांकनों की नकल नहीं कर सकते, जैसे मैट्रिक्स-बाउंड वृद्धि कारकों, सेल-सेल सिग्नलिंग, और स्थानिक जैव रासायनिक cues, जो कोशिकाओं पर आम प्रभावित कर रहे हैं । इसके अलावा, इस तरह के सब्सट्रेट कठोरता के रूप में मैट्रिक्स के भौतिक गुण, सेल भाग्य है, जो आसानी से पारंपरिक कोशिका संवर्धन प्रथाओं का उपयोग कर चालाकी नहीं है में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इस विधि में, हम एक सीधा प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए कृत्रिम पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) hydrogels photochemistry का उपयोग कर पर नमूनों में सक्रिय प्रोटीन प्रदान करते हैं । इस मंच सब्सट्रेट कठोरता और स्थानिक जैव रासायनिक cues के स्वतंत्र नियंत्रण के लिए अनुमति देता है । ये hydrogels शारीरिक रूप से प्रासंगिक कठोरता मूल्यों की एक बड़ी रेंज प्राप्त कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, इन hydrogels की सतहों thiol-िेने क्लिक रसायन प्रतिक्रियाओं के माध्यम से जैव सक्रिय पेप्टाइड्स या प्रोटीन के साथ photopatterned जा सकता है । इन तरीकों को सतह स्थिरीकरण के बाद प्रोटीन समारोह को बनाए रखने के लिए अनुकूलित किया गया है । यह एक बहुमुखी प्रोटोकॉल है कि किसी भी प्रोटीन या ब्याज की पेप्टाइड के लिए पैटर्न की एक किस्म बनाने के लिए लागू किया जा सकता है । वे स्थानिक विशिष्ट संकेतों का जवाब के रूप में अंत में, कोशिकाओं इन सक्रिय hydrogels की सतहों पर वरीयता प्राप्त समय पर नजर रखी जा सकता है ।

Introduction

वहां कई उत्तेजनाओं कि सेल व्यवहार को प्रभावित कर रहे हैं । आम तौर पर, ठेठ कोशिका संवर्धन तकनीकों में घुलनशील कारकों पर भरोसा करने के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया बटोरना; हालांकि, इस दृष्टिकोण के लिए सीमाएं हैं । इन पद्धतियों को सही रूप से vivo में पाया सभी संकेतन रूपांकनों को प्रदर्शित करने में असमर्थ हैं । इस तरह के संकेत तंत्र तनहा विकास कारकों, सेल सेल संकेत, और स्थानिक विशेष जैव रासायनिक cues शामिल हैं । इसके अलावा, सब्सट्रेट कठोरता सेल व्यवहार और स्टेम सेल भेदभाव में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते है और आसानी से आम सेल संवर्धन प्रथाओं1,2का उपयोग कर चालाकी नहीं है । इन संकेतन तंत्र की खोज शुरू करने के लिए एक नया मंच प्रदान करता है । विशेष रूप से, hydrogels सब्सट्रेट कठोरता3,4, स्थिर प्रोटीन और पेप्टाइड्स5,6, और स्थानिक विशिष्ट पैटर्न7बनाने की ट्यूनिंग के लिए उत्कृष्ट उंमीदवार हैं, 8.

Hydrogels सामांयतः extracellular मैट्रिक्स (ECM) के साथ अपने जैव रासायनिक समानताएं के कारण ऊतक इंजीनियरिंग में पाड़ के रूप में इस्तेमाल कर रहे है9,10। प्राकृतिक पॉलिमर पाड़ों के लिए आम पसंद कर रहे हैं, के रूप में वे संगत कर रहे हैं और शरीर के कई ऊतकों में पाए जाते हैं । सब्सट्रेट के रूप में प्राकृतिक पॉलिमर का उपयोग करने की सीमा है कि वे आसानी से bioconjugation के लिए रासायनिक moieties में हेरफेर की कमी है । दूसरी ओर, सिंथेटिक hydrogels, जैसे खूंटी, लक्षित chemistries11,12के लिए उत्कृष्ट प्लेटफार्मों रहे हैं । इसके अतिरिक्त, खूंटी hydrogels एक सेलुलर प्रतिक्रिया नहीं लाना है और इसलिए सक्रिय पाड़ बनाने के लिए निष्क्रिय रीढ़ के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं ।

जैव सक्रिय hydrogels बनाने के लिए, दोनों photopolymerization और thiol-िेने क्लिक रसायन प्रतिक्रियाओं कार्यरत हैं । इन photoreactions एक photoinitiator और एक यूवी प्रकाश स्रोत की आवश्यकता होती है । जब photoinitiators यूवी प्रकाश के लिए पेश कर रहे हैं, बांड को तोड़ने के कण के रूप में । अदब कण प्रतिक्रिया की शुरुआत के लिए आवश्यक हैं, लेकिन नकारात्मक प्रोटीन की12,13गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं । इसलिए, यह photoinitiator और यूवी जोखिम समय का अनुकूलन करने के लिए प्रोटीन की मात्रा को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है ।

इस विधि में, hydrogels acrylate-acrylate श्रृंखला वृद्धि photopolymerization के माध्यम से संश्लेषित कर रहे हैं । खूंटी-diacrylate (PEGDA) मोनोमर एक दूसरे के साथ प्रतिक्रिया शाखाओं में hydrogel की संरचना के लिए जिंमेदार बहुलक नेटवर्क के रूप में । जेल प्रणेता समाधान के भीतर PEGDA मोनोमर की एकाग्रता सब्सट्रेट कठोरता को नियंत्रित करेगा । hydrogel के छोटे ताकना आकार के कारण, fibronectin के रूप में ECM प्रोटीन आसानी से सेल लगाव के प्रयोजन के लिए hydrogel के भीतर शामिल किया जा सकता है । अंत में, इन hydrogels सतह-thiol-िेने क्लिक रसायन प्रतिक्रियाओं के माध्यम से जैव सक्रिय पेप्टाइड्स या प्रोटीन के साथ नमूनों किया जा सकता है । यहां, hydrogel प्रणाली के भीतर नि: शुल्क acrylates मुक्त thiols के साथ प्रतिक्रिया होगी प्रोटीन या पेप्टाइड पर स्थित है जब यूवी प्रकाश को उजागर । प्रोटीन या पेप्टाइड्स hydrogel सतह पर मैटीरियल हो जाने के बाद, hydrogel के बिना कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । यह सुविधा प्रदान करता है, लचीला प्रयोगात्मक योजना, और प्रयोगशालाओं के बीच सहयोग के लिए संभावना है । कुल मिलाकर, इस मंच यांत्रिक और स्थानिक जैव रासायनिक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है, एक दूसरे के स्वतंत्र, सेलुलर व्यवहार को प्रभावित करने के अवसर के लिए ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. Hydrogel संश्लेषण के लिए सामग्री तैयार करना

  1. PEGDA के शेयर समाधान तैयार, लिथियम फिनाइल-2, 4, 6-trimethylbenzoylphosphinate (गोद), और बाँझ शर्तों के तहत fibronectin और पर आधारित गणना (तालिका 1a).
    1. बाहर वजन और फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) में यौगिकों भंग । आमतौर पर, ५० और २०० मिलीग्राम/एमएल के बीच PEGDA काम कर समाधान सांद्रता बनाए रखने (5-20% वजन/ पिपेट के माध्यम से PEGDA समाधान के लिए एक ०.२२-& #181; मी सिरिंज फिल्टर नसबंदी के लिए.
      नोट: & #160; PEGDA समाधानों को प्रकाश से बचाने के लिए एक पन्नी लपेटने के साथ कवर रखें । PEGDA का एक ताजा समाधान तैयार (अनुशंसित) प्रत्येक प्रयोग के लिए ।
    2. गठन fibronectin प्रोटीन पाउडर के आधार पर निर्माता & #39; s सिफारिश. 1 मिलीग्राम/एमएल पर fibronectin स्टॉक समाधान बनाए रखने, aliquot यह ६० में १०० & #181; L aliquots, और उन पर स्टोर-20 & #176; C जब तक उपयोग करें । प्रयोग करने से पहले कई घंटे या रात भर के लिए 4 & #176; C पर aliquots को फ्रॉस्ट करें । यदि प्रोटीन स्टॉक बाँझ स्थितियों में पहले से ही उपलब्ध नहीं है, एक ०.२२ & #181 का उपयोग करें; मी सिरिंज फिल्टर नसबंदी के लिए.
      नोट: Fibronectin कक्ष अनुलग्नक के लिए उपयोग किया जाता है । अंय ECM प्रोटीन प्रतिस्थापित किया जा सकता है ।
    3. शेयर समाधान के लिए गोद बाहर वजन और पंजाब में इसे भंग; एक ठेठ स्टॉक एकाग्रता है 25 मिलीग्राम/एमएल । Sonicate यदि भंग होने से कोई परेशानी होती है । नसबंदी के लिए एक ०.२२ & #181; मी फिल्टर के माध्यम से समाधान पारित. एक पन्नी लपेटने के साथ गोद को ढक कर रखें और इसे 4 & #176; C को कई महीनों तक के लिए रख दें ।
      नोट: गोद photochemistry.
      4. के लिए इस्तेमाल किया photoinitiator है
  2. hydrogel गठन के लिए बाँझ गिलास स्लाइड मोल्ड तैयार करते हैं.
    1. आटोक्लेव एक पॉलिएस्टर शीट; एक एक जेल मोल्ड के लिए आवश्यक है । दो गिलास स्लाइड और तीन प्लास्टिक स्पेसर (०.५ मिमी मोटी) के लिए ७०% इथेनॉल में प्रत्येक जेल मोल्ड के लिए कम से 2 ज सोख, लेकिन आम तौर पर उंहें रात भर भिगोने की अनुमति । 10 मिनट के लिए उपयोग करने से पहले ७०% इथेनॉल में प्रत्येक जेल मोल्ड के लिए पांच बांधने की मशीन क्लिप सोख ।
    2. जगह ग्लास स्लाइड, स्पेसर, और बांधने की मशीन क्लिप सेल संस्कृति हूड में एक छोटे से autoclaved शीट पर उंहें कई घंटे के लिए शुष्क हवा के लिए अनुमति देते हैं ।
    3. एक गिलास स्लाइड के किनारे के आसपास प्लास्टिक स्पेसर रखकर hydrogel मोल्ड तैयार करते हैं । दूसरी ग्लास स्लाइड को टॉप पर रखें । सुरक्षित स्पेसर्स कसकर बांधने की मशीन क्लिप के साथ एक दूसरे के बगल में, प्रत्येक लंबे पक्ष और शीर्ष पर एक पर दो ।
      नोट: यदि यह ठीक से इकट्ठे नहीं है, जेल समाधान बाहर रिसाव होगा ।
    4. सतह-30 मिनट का उपयोग करने से पहले के लिए सेल संस्कृति हूड यूवी प्रकाश के साथ मोल्ड निष्फल । आधे रास्ते के माध्यम से, दोनों सतहों बेनकाब मोल्ड फ्लिप ।
< p class = "jove_title" > 2. एक मुक्त Thiol

  1. के साथ प्रोटीन को संशोधित करने के लिए प्रोटीन (तालिका 1a) पर Thiol में अमीन परिवर्तित करने के लिए स्प्रेडशीट से गणना का उपयोग कर शेयर समाधान तैयार.
    1. प्रतिक्रिया बफर बनाने के लिए, पंजाबियों पीएच 8 और 5 मिमी EDTA जोड़ने के लिए समायोजित करें । एक ०.२२ & #181 में पिपेट प्रतिक्रिया बफर; नसबंदी के लिए एम सिरिंज फिल्टर.
      नोट: EDTA महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह डाइसल्फ़ाइड बांड बनाने से thiols की रक्षा करता है । Thiol समूहों के होने की प्रतिक्रिया के लिए उनके कम फार्म में रहना चाहिए ।
    2. वजन 2-iminothiolane (Traut & #39; एस रिएजेंट) और यह प्रतिक्रिया बफर में भंग 2 मिलीग्राम/एमएल (14 मिमी) के एक शेयर समाधान एकाग्रता के लिए । नसबंदी के लिए एक ०.२२-& #181; m सिरिंज फिल्टर के माध्यम से समाधान पारित. स्टॉक समाधान को 4 & #176; C पर कई महीनों तक संग्रहीत करें ।
      नोट: 2-iminothiolane अणु कि विलायक उजागर प्रोटीन पर मुक्त अमीन के साथ प्रतिक्रिया करता है और उंहें मुक्त thiols में धर्मांतरित है ।
    3. ०.१ और 1 मिलीग्राम/एमएल के बीच एकाग्रता पर प्रतिक्रिया बफर में प्रोटीन का पुनर्गठन । जब तक पहले बाँझ, पिपेट के माध्यम से एक ०.२२-& #181 के माध्यम से इस समाधान, नसबंदी के लिए एम सिरिंज फिल्टर.
      नोट: यह प्रोटीन जैव रासायनिक संकेत है कि hydrogel सतह पर नमूनों किया जाएगा है । इसके अलावा, जबकि प्रोटीन सांद्रता भिंन हो सकते हैं, उच्च सांद्रता मजबूत प्रोटीन पैटर्न के लिए आदर्श होते हैं ।
  2. दोनों स्टॉक समाधान एक साथ मिश्रण द्वारा 2-iminothiolane के साथ प्रोटीन प्रतिक्रिया; सही वॉल्यूम अनुपात की गणना करने के लिए तालिका 1b का उपयोग करें । आमतौर पर, 8:1 2-iminothiolane के दाढ़ अनुपात का उपयोग करने के लिए प्रोटीन.
    नोट: बड़ा प्रोटीन या अधिक पतला सांद्रता के लिए, 2-iminothiolane के एक उच्च दाढ़ अनुपात का उपयोग करें । देखें निर्माता & #39; s प्रोटोकॉल < सुप class = "xref" > 15 .
  3. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए प्रतिक्रिया की मशीन । शेष reactants से thiolated प्रोटीन उत्पाद को निकालने के लिए एक लवण स्पिन माइक्रो-कॉलम का प्रयोग करें, निर्माता & #39 का अनुसरण करते हुए; s प्रोटोकॉल < सुप class = "xref" > 16 .
    नोट: इस राल की अपवर्जन सीमा 5 केडीए है.
  4. उपयोग Ellman & #39; s परख मात्रात्मक करने के लिए प्रोटीन प्रति मुक्त thiols की संख्या को मापने । परख के लिए निर्माता & #39; s प्रोटोकॉल का पालन करें < सुप वर्ग = "xref" > १७ .
< p class = "jove_title" > 3. Hydrogel गठन

  1. तालिका 1C से परिकलित मानों पर आधारित जेल प्रणेता समाधान बनाएँ. एक साथ मिश्रण PEGDA, fibronectin, और गोद संस्करणों । पिपेट समाधान सख्ती से एक समरूप समाधान सुनिश्चित करने के लिए, लेकिन बुलबुले बनाने से बचें । समाधान को प्रकाश से सुरक्षित रखें ।
  2. पिपेट जेल के प्रणेता समाधान ध्यान से जेल मोल्ड के दो गिलास स्लाइड के बीच । सामांयतया, ८०० और १,००० & #181 के बीच कोई खंड जोड़ें; L मोल्ड करने के लिए । मोल्ड में यूवी प्रकाश के लिए जेल समाधान बेनकाब (तरंग दैर्ध्य: ३६५ एनएम, पावर: 3-4 मेगावाट/सेमी 2 ) 1-2 मिनट के लिए hydrogel.
    फार्म नोट: लंबे समय तक यूवी प्रकाश के लिए hydrogel बेनकाब नहीं है, क्योंकि यह सतह प्रोटीन patterning क्षमताओं को सीमित करेगा ।
  3. बांधने क्लिप बंद ले और धीरे से दो पक्ष स्पेसर्स के लिए विपरीत दबाव लागू करके शीर्ष ग्लास स्लाइड को हटा दें ।
  4. hydrogel नमूनों में कटौती करने के लिए एक उचित आकार बायोप्सी पंच का उपयोग करें । बाहर पंच एकाधिक hydrogels जेल आयत से दोहराने और नियंत्रण नमूने के रूप में सेवा करने के लिए ।
< p class = "jove_title" > 4. एक 8 मिमी समानांतर प्लेट rheometer के लिए एक 8 मिमी व्यास बायोप्सी पंच के साथ Hydrogel कठोरता माप

  1. पंच बाहर hydrogels । rheometer में एक hydrogel नमूना लोड (सामग्री के तालिका देखें).
  2. समानांतर प्लेट ज्यामिति कि जेल की सतह के साथ संपर्क बनाने तक व्यास में 8 मिमी है कम । एक ०.५ मिमी-मोटी hydrogel नमूना के लिए ०.५ मिमी की अंतर दूरी रखें.
  3. ०.१% तनाव, ०.१ हर्ट्ज आवृत्ति पर 5 मिनट के लिए समय राज्यभर प्रदर्शन, और ३७ & #176; C. औसत हर बार झाडू के पार जी & #39; मान. प्रत्येक रचना की प्रतिकृति के लिए स्वतंत्र hydrogels चलाएँ.
    नोट: G & #39; मान समय बिंदुओं में स्थिर होना चाहिए; यदि वे नहीं हैं, तो प्रतिशत तनाव और आवृत्ति स्वीप करने के लिए उपयुक्त मान का चयन करने के लिए किया जाना चाहिए < सुप वर्ग = "xref" > १४ .
< p class = "jove_title" > 5. प्रोटीन patterning

  1. एक कंप्यूटर सहायता प्राप्त डिजाइन (सीएडी) कार्यक्रम का उपयोग photomask के लिए वांछित पैटर्न तैयार करते हैं । एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रिंटर का उपयोग कर एक पारदर्शी पत्रक पर photomask मुद्रित करें । उपयोग करने से पहले 10 मिनट के लिए ७०% इथेनॉल में photomask सोख । photomask एक सेल संस्कृति हूड में शुष्क हवा के लिए उपयोग करने से पहले की अनुमति दें ।
  2. सतह पैटर्न के लिए hydrogel की सतह के लिए चरण 2 में तैयार thiolated प्रोटीन समाधान जोड़ें । पिपेट 1-2 & #181; L/मुख्यमंत्री 2 के thiolated प्रोटीन समाधान प्रत्येक कट-आउट जेल की सतह के लिए ।
    नोट: यह प्रोटीन की मात्रा को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है; केवल काफी जोड़ने के लिए समान रूप से hydrogel नमूना की पूरी सतह को कवर ।
  3. सावधानी से photomask को hydrogel की सतह पर रखें । photomask और hydrogel सतह के बीच हवा के बुलबुले की अनुमति नहीं है । धीरे मुखौटा पर नीचे प्रेस किसी भी बुलबुले कि फार्म को हटाने के लिए ।
  4. यूवी प्रकाश की एक दूसरे दौर के लिए hydrogel बेनकाब (तरंग दैर्ध्य: ३६५ एनएम, पावर: 3-4 मेगावाट/सेमी 2 ) के लिए 30-60 s.
    नोट: यह प्रोटीन समारोह के नुकसान के कारण के बिना एक मजबूत पैटर्न बनाने के लिए पर्याप्त यूवी प्रकाश के लिए पैटर्न जोखिम के लिए महत्वपूर्ण है.
  5. hydrogels को हटाने के लिए पंजाबियों के साथ अच्छी तरह से प्लेट के भीतर एक hydrogel और जगह । एक अच्छी तरह से जैल में रखने जब सावधान रहना; सुनिश्चित करें कि नमूनों की सतह का सामना करना है । पंजाब में जैल धो 4 & #176; ग; जैल 4 & #176; C.
    6. पर कम से दो सप्ताह के लिए स्थिर हैं
< p class = "jove_title" > 6. सेल सीडिंग के लिए Hydrogels की तैयारी कर रहा है

  1. में 5-10 मिनट के लिए बेसल मध्यम में जैल मशीन ३७ & #176; C बोने से पहले । मानव गर्भनाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVECs) के लिए, विकास कारकों के बिना ईजीएम-2 मध्यम का उपयोग करें । मध्यम की मात्रा को कम करने के लिए एक अच्छी तरह से hydrogel अस्थाई रोकने के लिए जोड़ा । एक ४८-well प्लेट के लिए, एक २५० & #181 का उपयोग करें; एल मीडियम की मात्रा.
  2. 3 मिनट के लिए ३०० x g पर थाली नीचे स्पिन सुनिश्चित करें कि hydrogels अच्छी तरह से नीचे स्थित है और तैर नहीं कर रहे हैं । यह तुरंत सेल सीडिंग करने से पहले करें ।
< p class = "jove_title" > 7. सेल सीडिंग पर Hydrogels

  1. सेल सीडिंग और प्रायोगिक प्रक्रियाओं के लिए मानक बाँझ स्तनधारी कोशिका संस्कृति प्रक्रियाओं का उपयोग करें. मानक सेल टुकड़ी प्रोटोकॉल का उपयोग कर ऊतक संस्कृति कुप्पी से HUVECs निकालें । 3-5 मिनट के लिए trypsin के साथ बाँझ पंजाबियों और मशीन के साथ ऊतक संस्कृति पकवान धो ३७ & #176; C.
  2. अधिक सेल मध्यम या trypsin बेअसर समाधान के साथ trypsinized सेल निलंबन बुझाने.
  3. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक में सेल निलंबन नीचे स्पिन । ध्यान से supernatant निकालें और सेल गोली रखो ।
  4. कोई वृद्धि कारकों के साथ बेसल ईजीएम-2 में सेल गोली reसस्पेंड । कक्ष गणना के लिए एक hemocytometer का उपयोग करें ।
  5. जोड़ें ७५,००० कोशिकाओं/सेमी 2 प्रत्येक hydrogel सतह के लिए एक अच्छी तरह के केंद्र में धीरे से pipetting द्वारा ताकि जैल परेशान करने के लिए नहीं । एक सेल संस्कृति मशीन में अच्छी तरह से थाली प्लेस ३७ & #176; सी. कई दिनों के लिए, समय से अवलोकन के लिए पकवान हटा दें ।
< p class = "jove_title" > 8. ३७ & #176; सी और २०० rpm पर एक कक्षीय निलंबन में £ शोरबा में निलंबन में रात भर में एक
  1. संस्कृति ई. कोलाई का मूल्यांकन । ई. कोलाई संस्कृति, खिचड़ी भाषा नीचे स्पिन, और पंजाबियों की ंयूनतम मात्रा में सेल गोली का पुनर्गठन । lysozyme बाहर तौलना और 1 पर पुनर्गठन स्टॉक समाधान के लिए mg/
  2. पिपेट एक छोटा सा खंड (25 & #181; L) microcentrifuge ट्यूबों में lysozyme स्टॉक समाधान की. गोद photoinitiator के विभिंन स्तरों जोड़ें (0-12 mM) और यूवी प्रकाश के 1 मिनट के लिए नमूनों का पर्दाफाश । एक अलग समूह में, lysozyme समाधान के लिए (2 मिमी) गोद की एक ही राशि जोड़ें और यूवी प्रकाश टाइम्स (0-4 मिनट) अलग करने के लिए नमूनों का पर्दाफाश. प्रत्येक उपचार के लिए प्रतिकृति शामिल करें ।
  3. ०.५ मिलीग्राम/एमएल के एक अंतिम lysozyme प्रोटीन एकाग्रता के लिए प्रत्येक lysozyme नमूना के लिए केंद्रित ई. कोलाई समाधान के बराबर मात्रा में जोड़ें । कमरे के तापमान पर 4 एच के लिए मिश्रित समाधान मशीन ।
    नोट: यह कार्यात्मक lysozyme के लिए समय की अनुमति देता है बैक्टीरियल कोशिका दीवार लाइसे और समाधान में प्रोटीन जारी.
  4. एक सकारात्मक नियंत्रण के लिए ई. कोलाई के साथ मशीन अनुपचारित lysozyme का उपयोग करें; यह एक १००% सक्रिय माप पर विचार करें । एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में अकेले पंजाबियों के साथ मशीन lysozyme समाधान का प्रयोग करें ।
  5. सेल मलबे को हटाने और supernatant रखने के लिए नमूने नीचे स्पिन । जीवाणु lysate.
    6. की मात्रा को मापने के लिए supernatant के भीतर प्रोटीन की कुल एकाग्रता को मात्रा में लगाने के लिए एक ब्रैडफोर्ड परख भागो
  6. भागो एक ब्रैडफोर्ड परख निंनलिखित निर्माता & #39; s प्रोटोकॉल < सुप वर्ग = "xref" > १८ . नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में प्रोटीन एकाग्रता में गुना परिवर्तन की गणना.

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल खूंटी hydrogels की सतह पर सक्रिय पैटर्न बनाने के लिए चित्रा 1में सचित्र है । एक स्प्रेडशीट मात्रा और प्रत्येक शेयर समाधान (तालिका 1a) के लिए एकाग्रता की गणना करने के लिए विकसित किया गया था । प्रोटीन hydrogel की सतह पर स्थिर किया जा करने के लिए 2-iminothiolane (चित्रा 1बी) के साथ संशोधित कर रहे हैं । यह प्रतिक्रिया तालिका 1bसे वॉल्यूम का उपयोग करके की जाती है । प्रणेता hydrogel समाधान (चित्रा 1) गोद के साथ PEGDA की मात्रा 10% वजन के साथ तैयार है । विभिंन अग्रदूत PEGDA सांद्रता वांछित सब्सट्रेट कठोरता (चित्रा 2ए) उपज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । Fibronectin कक्ष अनुलग्नक प्रयोजनों के लिए इस प्रणेता समाधान के भीतर शामिल है । पूरी तरह से मिश्रण के बाद, इस समाधान तैयार मोल्ड में pipetted है और यूवी प्रकाश को उजागर (चित्रा 1सी) । यूवी प्रकाश जोखिम कम से कम किया जाना चाहिए; एक्सपोजर सिर्फ एक hydrogel का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए । Hydrogel नमूनों वांछित अच्छी तरह से प्लेट के लिए उपयुक्त व्यास के लिए बाहर छिद्रित कर रहे हैं (चित्रा 1सी). सतह नमूनों के लिए, संशोधित प्रोटीन समाधान एक hydrogel की सतह पर pipetted और समान रूप से फैल रहा है । न्यूनतम मात्रा का उपयोग किया जाना चाहिए; प्रोटीन की मात्रा बस hydrogel की पूरी सतह को कवर करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए । डिज़ाइन photomask सीधे hydrogel सतह पर रखा गया है; मुखौटा और hydrogel के बीच हवा के बुलबुले से बचना चाहिए । यूवी प्रकाश के एक दूसरे दौर hydrogel करने के लिए संयुग्म यूवी उजागर प्रोटीन covalently करने के लिए प्रयोग किया जाता है । Hydrogel नमूनों को प्रतिक्रियात्मक प्रोटीन को दूर करने के लिए कुल्ला कर रहे है और मैटीरियल प्रोटीन पैटर्न (चित्रा 1डी) प्रकट करते हैं ।

यह प्रोटीन मौजूद हैं जब photoinitiator एकाग्रता और यूवी जोखिम समय को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक संकेतक के रूप में lysozyme का उपयोग कर, हमने पाया है कि गोद photoinitiator एकाग्रता से कम होना चाहिए 2 मिमी (चित्रा 2बी) और यूवी जोखिम समय से कम कुल चाहिए 2 मिनट (चित्रा 2सी) एक प्रोटीन बनाए रखने के लिए अधिक से अधिक ८०% की गतिविधि ।

hydrogel गठन और प्रोटीन patterning के दौरान यूवी जोखिम समय एक सफल प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए दोनों महत्वपूर्ण पैरामीटर है (चित्रा 3) । सबसे पहले, hydrogel गठन के दौरान यूवी जोखिम को कम करने के बाद प्रोटीन स्थिरीकरण प्रतिक्रियाओं के लिए नि: शुल्क acrylate कार्यात्मक समूहों को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है (चित्रा 3) । Hydrogels से अधिक समय के लिए यूवी प्रकाश से अवगत कराया 2 मिनट के लिए मैटीरियल प्रोटीन पैटर्न बनाने में असमर्थ हैं । इसके अतिरिक्त, प्रोटीन पैटर्न के लिए यूवी जोखिम के रूप में बढ़ जाती है, और अधिक प्रोटीन सतह (चित्रा 3बी) के लिए प्रतिक्रिया ।

अंत में, कोशिकाओं इन नमूनों hydrogel सब्सट्रेट पर प्रसंस्कृत किया जा सकता सेल व्यवहार में हेरफेर करने के लिए । hydrogels पर स्थिर पैटर्न की क्षमता दिखाने के लिए, हम वीईजीएफ़ पैटर्न, endothelial कोशिकाओं के लिए एक विकास कारक महत्वपूर्ण है, और बेसल ईजीएम-2 मध्यम (चित्रा 4) का उपयोग कर सतह पर संस्कृतिित HUVECs. HUVECs समान रूप से वीईजीएफ़-नमूनों खूंटी hydrogels (चित्रा 4ए) की सतह पर वरीयता प्राप्त थे । बोने के दो दिन बाद, HUVECs hydrogel के स्थानिक क्षेत्रों की ओर पलायन करने के लिए मनाया गया है कि शामिल मैटीरियल वीईजीएफ़ (चित्रा 4बी, सी) । यह खूंटी hydrogels पर एक सक्रिय प्रोटीन पैटर्न का एक उदाहरण के लिए सेल व्यवहार को प्रभावित किया जा रहा है ।

Figure 1
चित्र 1: hydrogel गठन और प्रोटीन के नमूनों की योजनाबद्ध । (क) कोशिका आसक्ति के लिए PEGDA मोनोमर, photoinitiator, और extracellular प्रोटीन के साथ प्रणेता hydrogel समाधान तैयार करें. (B) 2-iminothiolane के साथ प्रतिक्रिया द्वारा मुक्त thiol समूहों के साथ प्रोटीन को संशोधित करें । (C) पिपेट तैयार मोल्ड में प्रणेता समाधान को उजागर करता है और hydrogel बनाने के लिए यूवी लाइट को बेनकाब करता है । वांछित आकार के hydrogel नमूने बाहर पंच । (D) hydrogel की सतह पर संशोधित प्रोटीन समाधान पिपेट, सतह पर एक photomask लगाएं, और इसे यूवी प्रकाश के दूसरे दौर में बेनकाब करें । जेल कुल्ला करने के लिए इमेजिंग और सेल सीडिंग से पहले प्रतिक्रिया व्यक्त की प्रजातियों को दूर । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : कठोरता और प्रोटीन का नियमन करने वाली । (क) PEGDA मोनोमर के प्रणेता जेल समाधान के भीतर एकाग्रता में परिवर्तन hydrogel कठोरता में बदल जाते हैं. (ख) गोद photoinitiator की एकाग्रता बढ़ाने यूवी जोखिम के 1 मिनट के बाद प्रोटीन समारोह कम करती है । (ग) बढ़ती यूवी जोखिम समय 2 मिमी गोद के साथ प्रोटीन समारोह कम करती है । सभी त्रुटि पट्टियां दोहराने के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: पैटर्न और hydrogel यूवी जोखिम बार प्रोटीन patterning के लिए अनुकूलित । (क) hydrogel गठन के लिए यूवी एक्सपोजर बार ंयूनतम सतह पैटर्न के लिए अनुमति देता है । (ख) सतह patterning पैटर्न शक्ति बढ़ जाती है के लिए यूवी जोखिम समय बढ़ रही है । स्केल बार्स = २०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: Endothelial एक वीईजीएफ़ प्रतिमान का प्रतिसाद देने वाले कक्ष. (क) hydrogels पर समान HUVECs वरीयताएं । (ख और ग) HUVECs वीईजीएफ़ पैटर्न को समझ कर मैटीरियल वीईजीएफ़ की ओर पलायन करते हैं । चित्र (B) 4x और (C) 10x आवर्धन में बोने के बाद दो दिन लग गए थे । स्केल पट्टियां = ५०० µm. HUVEC-RFPs (लाल) और वीईजीएफ़-४८८ प्रतिमान (हरा) क्रमशः 528/553 और 465/495 पर उत्तेजना और उत्सर्जन फ़िल्टर के साथ कैप्चर किए गए । इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Table 1
तालिका 1: स्टॉक और जेल के लिए परिकलन प्रणेता समाधान. लाल बॉक्स इस तरह के आणविक वजन, वांछित शेयर सांद्रता, और तौला बाहर जनता के रूप में उपयोगकर्ता परिभाषित मूल्यों, इंगित करता है । नीला बक्से उन मानों का प्रतिनिधित्व करते है जिनकी गणना यूज़र-डिफ़ाइंड मानों के आधार पर की गई है ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल जैविक अनुप्रयोगों के लिए जैव सक्रिय प्रोटीन पैटर्न बनाने के लिए एक विधि प्रदान करता है । कई संशोधनों कि विभिंन प्रयोगों के लिए इस प्रोटोकॉल अनुकूलन किया जा सकता है । पहले, कक्ष अनुलग्नक आवश्यकताएं भिंन कक्ष प्रकारों के लिए भिंन होंगी । अगर जैल के लिए गरीब कोशिका लगाव शुरू में मनाया जाता है, तो अग्रदूत समाधान के भीतर ECM प्रोटीन की एकाग्रता में वृद्धि की सलाह दी है । अंय ECM प्रोटीन के बजाय fibronectin, कोलेजन, laminin, या तत्संबंधी संयोजन के विभिंन प्रकार सहित इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रत्येक नए कक्ष प्रकार के लिए, कक्ष अनुलग्नक को hydrogel प्रतिमान से पहले ऑप्टिमाइज़ किया जाना चाहिए । इस प्रोटोकॉल भी उपयोगकर्ता के लिए अनुमति देता है, photomasks डिजाइन । वांछित आवेदन के आधार पर, photomasks विभिन्न सुविधा आकार, आकार, और समग्र पैटर्न के साथ उत्पादन किया जा सकता है । एक photomask के अभाव में समान स्थिरीकरण प्राप्त किया जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं हैं । के रूप में प्रतिनिधि परिणामोंमें प्रकाश डाला, इस विधि हर कदम पर यूवी प्रकाश की मात्रा के प्रति संवेदनशील है । hydrogel गठन चरण के दौरान अधिक जोखिम क्रमिक सतह bioconjugation के लिए उपलब्ध acrylate समूह को सीमित करता है । इसलिए, इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम अच्छी तरह से प्रबंधित यूवी प्रकाश जोखिम बार हर कदम के लिए है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल सफल patterning के लिए एक उच्च एकाग्रता प्रोटीन स्टॉक की आवश्यकता है । प्रोटीन की कम सांद्रता खराब सतह पैटर्न में परिणाम होगा । इसके अतिरिक्त, photomasks भी है कि वे केवल असतत पैटर्न का उत्पादन कर सकते में सीमित हैं । अधिक जटिल पैटर्न समान दृष्टिकोण के साथ प्राप्त किया जा सकता है लेकिन एक अधिक उंनत पद्धति की आवश्यकता है ।

यह प्रोटोकॉल मौजूदा तरीकों के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में यह सब्सट्रेट कठोरता और प्रोटीन पैटर्न समायोजन के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता है । hydrogel गठन के लिए acrylate रसायन विज्ञान का प्रयोग शारीरिक रेंज के भीतर सब्सट्रेट कठोरता की एक परिमाण रेंज के लिए अनुमति देता है । बस PEGDA के प्रणेता समाधान के भीतर एकाग्रता का समायोजन hydrogel कठोरता पर नियंत्रण देता है । इसके अतिरिक्त, प्रोटीन पैटर्न के लिए क्लिक रसायन विज्ञान का उपयोग hydrogel सब्सट्रेट और thiolated संशोधित प्रोटीन के बीच तेजी से विकार के लिए अनुमति देता है । यह एक महत्वपूर्ण डिजाइन सुविधा है, क्योंकि यह इस प्रोटोकॉल किसी भी प्रोटीन या ब्याज की पेप्टाइड के लिए लागू होने की अनुमति देता है ।

खूंटी hydrogels जैविक प्रणालियों के लिए जैव रासायनिक cues प्रदर्शित करने के लिए नए प्लेटफार्मों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि सामग्री का वादा कर रहे हैं । क्या वर्दी सतह स्थिरीकरण या स्थानिक विशिष्ट पैटर्न, इन तकनीकों उपंयास तरीके सेल व्यवहार को नियंत्रित करने के लिए प्रदान करते हैं । आगे बढ़ते हुए, भौतिक प्रौद्योगिकी की उंनति सेल व्यवहार में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा और आगे के लिए हमारी क्षमताओं को vivo में संकेत रूपांकनों में दोहराऊंगा करने के लिए इन विट्रो प्रणालियों के भीतर । यह एक नियंत्रित प्रयोगात्मक प्रणाली के भीतर स्टेम सेल भेदभाव और मॉडलिंग विकासात्मक संकेत के लिए फायदेमंद हो सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह अध्ययन मुख्य रूप से अमेरिकी हार्ट एसोसिएशन वैज्ञानिक विकास अनुदान (12SDG12050083 से G.D.), स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R21HL102773, R01HL118245 G.D.) और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (CBET-१२६३४५५ से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था और CBET-१३५०२४० से G.D.) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PEG-diacrylate (PEGDA) Laysan Bio ACRL-PEG-ACRL-3400 Can also be synthesized or purchased through other venders. Different molecular weights can be used.
Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Synthesized in lab
Fibronectin Corning 356008 Other cell attachment proteins can be used, such as laminin, matrigel
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma D8537-500ML
Photomask FineLine Imaging n/a Custom prints on transparent sheets with high resolution DPI.
Binder Clips Various Vendors
Compact UV Light Source (365nm) UVP UVP-21 Other UV light sources can be used, calibration of power is required.
2-iminothiolane (Pierce Traut’s Reagent) Thermo Sci. 26101
Ellman’s Reagent: DTNB; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) Thermo Sci. 22582
human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) Lonza passage number between 6- 10
EGM-2 Media Lonza CC31-56, CC-3162 EGM-2 without growth factors was used in experiments. Full EGM-2 media was used for cell maintainance
0.25% Trypsin EDTA Life Tech 25200-056
Trypsin Neutralizer Life Tech R-002-100
Centrifuge Various Venders
Hemocytometer Hausser Sci. Bright-line
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich E6758
0.22µm filter Cell Treat 229743
1mL Syringe
Glass Microscope Slides Fisher Sci. 12-550C
Plastic spacers Various Venders 0.5mm thickness
70% Ethanol BICCA 2546.70-1
Bio-shield Bio-shield 19-150-0010
Bradford Reagent  BIO-RAD
Desalting Resin - Sephadex G-25 GE Healthcare 95016-754
Microspin Columns Thermo Sci. PI69725
AR-G2 rehometer TA Instruments

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References

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अभियांत्रिकी अंक १२७ सामग्री सेल संस्कृति पाड़ photopatterning hydrogel thiol-िेने bioconjugation hydrogel
Hydrogel पर जैव सक्रिय प्रोटीन या पेप्टाइड्स पैटर्न जैविक अनुप्रयोगों के लिए Photochemistry का उपयोग
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Dorsey, T. B., Grath, A., Xu, C.,… More

Dorsey, T. B., Grath, A., Xu, C., Hong, Y., Dai, G. Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications. J. Vis. Exp. (127), e55873, doi:10.3791/55873 (2017).

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