JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
의학

Расследование фон Виллебранда фактор патофизиологии с помощью потока камеры модели фон Виллебранда фактор тромбоцитов строки формирования

Published: August 14, 2017
doi:
10.3791/55917
, , , ,
1Department of Pathology and Molecular Medicine,Queen’s University, 2Department of Medicine,Queen’s University

Summary

В настоящем документе мы описываем метода для оценки эндотелиальной Виллебранда коэффициент выпуска и последующие тромбоцитов захвата под жидкости касательное напряжение в ответ на воспалительные раздражителей, с помощью системы камеры потока в пробирке .

Abstract

Фактор Виллебранда (VWF) является фактор свертывания гликопротеин multimeric которая опосредует тромбоцитов адгезии и агрегации в местах повреждения эндотелия и что несет фактора VIII в циркуляции. VWF синтезируется эндотелиальных клеток и конститутивно высвобождается в плазме или хранится в специализированные органеллы, называется Weibel-Паладе органов (WPBs), для выпуска по требованию в ответ на вызов гемостаза. Быстро procoagulant и провоспалительных раздражителей может вызвать WPB экзоцитоз и VWF выпуска. Большинство VWF выпущенное эндотелиальных клеток циркулирует в плазме; Однако доля VWF привязанный к поверхности эндотелиальных клеток. В условиях физиологического сдвига эндотелиальные якорь VWF можно связать тромбоцитов, образуя VWF-тромбоцитов строку, которая может представлять очагов тромбообразованию. Камерная система потока может использоваться визуально наблюдать за освобождение VWF из эндотелиальных клеток и последующие тромбоцитов захватить образом, воспроизводимые и отношение к патофизиологии VWF-опосредованной тромбообразованию. Используя эту методологию, эндотелиальные клетки культивировали в камере потока и впоследствии стимулируются с secretagogues побудить WPB экзоцитоз. Промывают тромбоцитов затем увлажненную над активированные эндотелия. Тромбоциты активируются и впоследствии связать удлиненные VWF строки в направлении потока жидкости. С помощью внеклеточного гистонами как procoagulant и провоспалительных стимул, мы наблюдали повышенное образование строку VWF-тромбоцитов на лечение гистона эндотелиальных клеток, по сравнению с необработанными эндотелиальных клеток. Этот протокол описывает количественные, визуальные и реального времени оценки активации VWF-тромбоцитов взаимодействий в моделях тромбоза и гемостаз.

Introduction

Тромбоз является ведущей причиной смертности во всем мире1 и может развиваться в ответ todysregulated тромбоцитов активации и тромбина поколения в обоих расширение артерий. Плазменные уровни VWF являются ключевым регулятором свертывающей системы крови, при котором низкий уровень (< 50%) привести в нарушение свертываемости крови, известный как Виллебранда болезни (VWD)2 и высокие уровни (> 150%), связанные с повышенным риском венозного3 и тромбоз артерий4 .

VWF это гликопротеин multimeric синтезированы megakaryocytes и эндотелиальных клеток и хранится в α-гранулы тромбоцитов и WPBs, соответственно. После гемостаза вызов VWF могут быть освобождены от эндотелия WPBs привязать циркулирующих тромбоцитов активированные эндотелиальные клетки5 или подвергаются коллагена на судно стены6. Анкеровка VWF эндотелиальных клеток было показано, быть опосредовано P селектина7 и Интегрин альфаvβ38. Последующий релиз магазинов α-гранулы тромбоцитов может еще больше повысить локализованных VWF концентрации для стабилизации тромбоцитов тромбоцитов взаимодействий для формирования вилка тромбоцитов, леска, необходимые для распространения каскад свертывания крови и фибрин осаждения. Тромбоциты привязки активность VWF регулируется по своей структуре multimeric, высокомолекулярный вес мультимеры, обладающие большей кровоостанавливающее действие9,10. В обращении VWF также выступает в качестве носителя для коагуляционного фактора VIII.

Жидкости касательное напряжение является важным регулятором VWF физиологии. В отсутствие напряжения сдвига VWF существует в шарообразную форму, сокрытие связывания доменов для тромбоцитов гликопротеина Ib адгезии11. Когда присутствует напряжение сдвига, расщепление сайт для metalloprotease, Дизинтегрин и metalloprotease с мотивом тромбоспондин (ADAMTS13), подвергается. ADAMTS13 расщепляет голый и тромбоцитов оформленный VWF строк регулировать размер multimer, тем самым уменьшая его кровоостанавливающее действие12.

VWF — белок острой фазы, и было показано, что многочисленные стимулы, включая гипоксии13, инфекции14и провоспалительных цитокинов, посреднические VWF освобождения из эндотелиальных клеток. Похож на другие воспалительные агенты, внеклеточная гистонами также было показано, побудить системных VWF выпуска в мышей15,16 и активации тромбоцитов в vitro17,18, 19. это было показано зависел гистона подтип, как различия в лизине и содержание аргинина может повлиять на функции15. Наши исследования стремится создать камеру потока модели в том, чтобы исследовать влияние лизин-богатые люди (HK) и аргинин богатые подтипы гистонов (HR) и secretagogues на эндотелиальных VWF выпуска и тромбоцитов в реальном времени захвата, потенциал раннего события воспаление индуцированной тромбоза.

Эта методология камеры потока резюмирует в естественных условиях взаимодействия между субэндотелиальном коллагена, эндотелиальные клетки, VWF и тромбоцитов в системе в пробирке , визуальные, воспроизводимые и поддающихся количественной оценке. Это позволяет в реальном времени оценки всех аспектов путь, который регулирует VWF-тромбоцитов взаимодействия, включая WPB секреции, активации тромбоцитов и VWF протеолиза. ADAMTS135использовали для оценки VWD мутации, которые ослабляют VWF выпуска и тромбоцитов привязки функции20, WPB физиологии21и VWF расщепления исследования VWF при сдвиге в контролируемых условиях. Мы используем эту методологию количественной оценки формирования строки VWF-тромбоцитов вследствие воспалительных стимул: внеклеточная гистонами.

Protocol

Эти исследования были утверждены исследовательской этики Совет королевы университет, Канада. 1. эндотелиальных клеток стимуляция Коллаген слой пластины 6-ну тканевые культуры. 24 часа заранее, Пальто плиты 6-ну тканевые культуры при 37 ° C с 1 мл раствора …

Representative Results

Чтобы непосредственно оценить влияние гистонами VWF освобождения из эндотелиальных клеток, мы подвергаемся вырожденная BOECs сыворотки бесплатно средних содержащие PMA (положительный контроль), UH, HR и HK за 2 ч. Мы показали, что HK индуцированной 2 раза увеличение VWF белка (VWF:Ag)…

Discussion

В то время как физиологические актуальность VWF-тромбоцитов строк остается спорным из-за их быстрое растворение в присутствии VWF-раскалывание протеазы ADAMTS13, они служат модель количественно в vitro тромбоцитов вербовки VWF на сайт на которые могли тромба в присутствии из локализованных…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Элисон Михельс является получателем Фредерик Banting и Чарльз Лучшие Канада выпускников стипендии от канадской институтов здравоохранения исследований (КНИИЗ). Лаура л Swystun является получателем стипендий КНИИЗ. Дэвид Lillicrap является получателем Канада исследований кафедры в молекулярной гемостаз. Это исследование финансировалось частично КНИИЗ действующих грантов (СС-97849).

Materials

Calf-thymus unfractionated histones (UH) Worthington Biochemical HLY Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus lysine-rich histones (HK) Sigma-Aldrich H5505 Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus arginine-rich histones (HR) Sigma-Aldrich H4830 Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139 Reconstituted in DMSO (20 mM)
Histamine Sigma-Aldrich H7125-1G Reconstituted in water (50 mg/mL)
3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6) Invitrogen D273 Reconstituted in methanol (20 mM)
Rabbit Anti-VWF Coating Antibody DAKO A0082 For VWF ELISA
Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated DAKO P0026 For VWF ELISA and histone-VWF binding assay
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates eBioscience 44-2404-21 For histone-VWF binding assay
Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates Thermo Scientific 3855 For VWF ELISA
Humate-P CSL Behring N/A Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex
Normal Reference Plasma Precision BioLogic CCNRP-05 For VWF ELISA standard curve
O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent Sigma-Aldrich P8287 Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162 For culturing and initial seeding of BOEC
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14025092
Rat-tail Collagen Type 1 Corning 354236
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media ThermoFisher Scientific 31985070 For endothelial cell stimulations
METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software Molecular Devices N/A
BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive BD Biosciences 366703
µ-Slide III 0.1 (flow chambers) Ibidi This product has been discontinued. We suggest using µ-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2
Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized Ibidi 10842
Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized Ibidi 10825
Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized Ibidi 10802
Blunted 18G Needle BD Biosciences 305180
20 mL syringes BD Biosciences 302830
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM N/A
Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope Quorum Technologies N/A
Image Processing Software ImageJ N/A
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics–2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
  2. Sadler, J. E. von Willebrand factor: two sides of a coin. J Thromb Haemost. 3 (8), 1702-1709 (2005).
  3. Koster, T., Blann, A. D., Briët, E., Vandenbroucke, J. P., Rosendaal, F. R. Role of clotting factor VIII in effect of von Willebrand factor on occurrence of deep-vein thrombosis. Lancet. 345 (8943), 152-155 (1995).
  4. Morange, P. E., et al. Endothelial Cell Markers and the Risk of Coronary Heart Disease: The Prospective Epidemiological Study of Myocardial Infarction (PRIME) Study. Circulation. 109 (11), 1343-1348 (2004).
  5. Dong, J. F., et al. ADAMTS-13 rapidly cleaves newly secreted ultralarge von Willebrand factor multimers on the endothelial surface under flowing conditions. Blood. 100 (12), 4033-4039 (2002).
  6. Ruggeri, Z. M. Von Willebrand factor, platelets and endothelial cell interactions. J Thromb Haemost. 1 (7), 1335-1342 (2003).
  7. Padilla, A., et al. P-Selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface P-selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface. Blood. 103 (6), 2150-2156 (2004).
  8. Huang, J., Roth, R., Heuser, J. E., Sadler, J. E. Integrin alpha v beta 3 on human endothelial cells binds von Willebrand factor strings under fluid shear stress. Blood. 113 (7), 1589-1598 (2009).
  9. Moake, J. L., Turner, N. A., Stathopoulos, N. A., Nolasco, L. H., Hellums, J. D. Involvement of large plasma von Willebrand Factor (vWF) multimers and unusually large vWF forms derived from endothelial cells in shear stress-induced platelet aggregation. J Clin Invest. 78 (6), 1456-1461 (1986).
  10. Federici, a. B., Bader, R., Pagani, S., Colibretti, M. L., De Marco, L., Mannucci, P. M. Binding of von Willebrand factor to glycoproteins Ib and IIb/IIIa complex: affinity is related to multimeric size. Br J Haematol. 73, 93-99 (1989).
  11. Goto, S., Salomon, D. R., Ikeda, Y., Ruggeri, Z. M. Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willebrand Factor to Platelets Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willeb. J Biol Chem. 270 (40), 23352-23361 (1995).
  12. Shim, K., Anderson, P. J., Tuley, E. A., Wiswall, E., Sadler, J. E. Platelet-VWF complexes are preferred substrates of ADAMTS13 under fluid shear stress. Blood. 111 (2), 651-657 (2008).
  13. Pinsky, D. J., et al. Hypoxia-induced exocytosis of endothelial cell weibel-palade bodies: A mechanism for rapid neutrophil recruitment after cardiac preservation. J Clin Invest. 97 (2), 493-500 (1996).
  14. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of Weibel-Palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cell Microbiol. 14 (2), 210-225 (2012).
  15. Michels, A., et al. Histones link inflammation and thrombosis through the induction of Weibel – Palade body exocytosis. J Thromb Haemost. 14 (11), 2274-2286 (2016).
  16. Brill, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (1), 136-144 (2012).
  17. Semeraro, F., et al. Extracellular histones promote thrombin generation through platelet-dependent mechanisms: involvement of platelet TLR2. Blood. 118 (7), 1952-1961 (2011).
  18. Ammollo, C. T., Semeraro, F., Xu, J., Esmon, N. L., Esmon, C. T. Extracellular histones increase plasma thrombin generation by impairing thrombomodulin-dependent protein C activation. J Thromb Haemost. 9 (9), 1795-1803 (2011).
  19. Carestia, A., Rivadeneyra, L., Romaniuk, M. A., Fondevila, C., Negrotto, S., Schattner, M. Functional responses and molecular mechanisms involved in histone-mediated platelet activation. Thromb Haemost. 110 (5), 1035-1045 (2013).
  20. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121 (14), 2762-2772 (2013).
  21. Ferraro, F., et al. Weibel-Palade body size modulates the adhesive activity of its von Willebrand Factor cargo in cultured endothelial cells. Sci Rep. 6, 32473 (2016).
  22. Starke, R. D., et al. Cellular and molecular basis of von Willebrand disease: studies on blood outgrowth endothelial cells. Blood. 121 (14), 2773-2784 (2013).
  23. Ormiston, M. L., et al. Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood. J Vis Exp. (106), e53384 (2015).
  24. Xu, J., et al. Extracellular histones are major mediators of death in sepsis. Nat Med. 15 (11), 1318-1321 (2009).
  25. Abrams, S. T., et al. Circulating histones are mediators of trauma-associated lung injury. Am J Respir Crit Care Med. 187 (2), 160-169 (2013).
  26. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Choi, H., Moake, J. L., Dong, J. F. Platelets adhered to endothelial cell-bound ultra-large von Willebrand factor strings support leukocyte tethering and rolling under high shear stress. J Thromb Haemost. 3 (3), 562-570 (2005).
  27. Hewlett, L., et al. Temperature-dependence of weibel-palade body exocytosis and cell surface dispersal of von willebrand factor and its propolypeptide. PLoS ONE. 6 (11), (2011).
  28. Lam, F. W., Cruz, M. A., Parikh, K., Rumbaut, R. E. Histones stimulate von Willebrand factor release in vitro and in vivo. Haematologica. 101 (7), e277-e279 (2016).
  29. Zheng, Y., Chen, J., López, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat Commun. 6 (7858), (2015).
  30. Ward, C. M., Tetaz, T. J., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Binding of the von Willebrand factor A1 domain to histone. Thromb Res. 86 (6), 469-477 (1997).
  31. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand-factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  32. De Ceunynck, K., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K. Unwinding the von Willebrand factor strings puzzle. Blood. 121 (2), 270-277 (2013).
  33. Petri, B., et al. von Willebrand factor promotes leukocyte extravasation. Blood. 116 (22), 4712-4719 (2010).
  34. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), 1-13 (2012).
  35. Wang, J. W., et al. Formation of platelet-binding von Willebrand factor strings on non-endothelial cells. J Thromb Haemost. 10 (10), 2168-2178 (2012).
  36. Yamamoto, K., de Waard, V., Fearns, C., Loskutoff, D. J. Tissue Distribution and Regulation of Murine von Willebrand Factor Gene Expression In Vivo. Blood. 92 (8), 2791-2801 (1998).
  37. Shahani, T., Lavend’homme, R., Luttun, A., Saint-Remy, J. M., Peerlinck, K., Jacquemin, M. Activation of human endothelial cells from specific vascular beds induces the release of a FVIII storage pool. Blood. 115 (23), 4902-4909 (2010).
  38. Wu, S., et al. CaV3.1 (α1G) T-type Ca2+ channels mediate vaso-occlusion of sickled erythrocytes in lung microcirculation. Circ Res. 93 (4), 346-353 (2003).
  39. Knop, M., Gerke, V. Ca2+ -regulated secretion of tissue-type plasminogen activator and von Willebrand factor in human endothelial cells. Biochim Biophys Acta. 1600 (1-2), 162-167 (2002).
  40. Vischer, U., Wollheim, C. Epinephrine induces von Willebrand factor release from cultured endothelial cells: involvement of cyclic AMP-dependent signalling in exocytosis. Thromb Haemost. 77 (6), 1182-1188 (1997).
  41. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  42. Kumar, R. A., Dong, J. F., Thaggard, J. A., Cruz, M. A., López, J. A., McIntire, L. V. Kinetics of GPIbalpha-vWF-A1 tether bond under flow: effect of GPIbalpha mutations on the association and dissociation rates. Biophys J. 85 (6), 4099-4109 (2003).
  43. Lipowsky, H. H., Usami, S., Chien, S. In vivo measurements of "apparent viscosity" and microvessel hematocrit in the mesentery of the cat. Microvasc Res. 19 (3), 297-319 (1980).
  44. De Ceunynck, K., et al. Local elongation of endothelial cell-anchored von Willebrand factor strings precedes ADAMTS13 protein-mediated proteolysis. J Biol Chem. 286 (42), 36361-36367 (2011).
  45. Coburn, L. A., Damaraju, V. S., Dozic, S., Eskin, S. G., Cruz, M. A., McIntire, L. V. GPIbalpha-vWF rolling under shear stress shows differences between type 2B and 2M von Willebrand disease. Biophys J. 100 (2), 304-312 (2011).
  46. Dong, J. F., et al. Magnesium maintains endothelial integrity, up-regulates proteolysis of ultra-large von Willebrand factor, and reduces platelet aggregation under flow conditions. Thromb Haemost. 99 (3), 586-593 (2008).

Tags

Von Willebrand FactorVWF-platelet String FormationFlow Chamber ModelCollagenEndothelial CellsPlateletsSecretagoguesIn VitroMicroscopySyringe Pump

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. J. Vis. Exp. (126), e55917, doi:10.3791/55917 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image