JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
의학

Onderzoeken van von Willebrand Factor pathofysiologie met behulp van een Flow kamer Model van von Willebrand Factor-bloedplaatjes String vorming

Published: August 14, 2017
doi:
10.3791/55917
, , , ,
1Department of Pathology and Molecular Medicine,Queen’s University, 2Department of Medicine,Queen’s University

Summary

In deze paper beschrijven we een methode om te beoordelen endothelial von Willebrand factor release en de daaropvolgende bloedplaatjes vangen onder vloeistof shear stress in reactie op inflammatoire stimuli met behulp van een in vitro kamer-stroomsysteem.

Abstract

Von Willebrand-factor (VWF) is een multimeric glycoproteïne stollingsfactor die bemiddelt adhesie van bloedplaatjes en aggregatie op sites van endothelial schade en dat draagt factor VIII in de omloop. VWF wordt gesynthetiseerd door endotheliale cellen en ofwel constitutively in het plasma wordt vrijgegeven of is opgeslagen in gespecialiseerde organellen, Weibel-Palade instanties (WPBs), genaamd voor op afroep release in antwoord op hemostatische uitdaging. Procoagulatie en proinflammatoire stimuli kunnen snel leiden tot WPB exocytose en VWF release. De meerderheid van de VWF uitgebracht door endotheliale cellen circuleert in het plasma; echter wordt een deel van VWF verankerd aan het endotheel celoppervlak. Onder voorwaarden van fysiologische schuintrekken, kunt endotheel-verankerd VWF binden aan bloedplaatjes, vormen een VWF-bloedplaatjes tekenreeks die de infectiehaard voor de vorming van trombose vertegenwoordigen kan. Een kamer-stroomsysteem kan worden gebruikt om het visueel waarnemen van de vrijlating van VWF uit endotheliale cellen en de daaropvolgende bloedplaatjes vastleggen op een wijze die reproduceerbaar zijn en relevant zijn voor de pathofysiologie van VWF-gemedieerde trombose vorming. Met behulp van deze methode, endotheliale cellen zijn gekweekt in een flow kamer en vervolgens gestimuleerd met secretagogues voor het opwekken van WPB exocytose. Gewassen bloedplaatjes zijn dan geperfundeerd over de geactiveerde endotheel. De bloedplaatjes zijn geactiveerd en vervolgens binden aan de verlengde VWF tekenreeksen in de richting van vloeistofstromen. Met behulp van extracellulaire histonen als een stimulans procoagulatie- en proinflammatoire, waargenomen we verhoogde VWF-bloedplaatjes tekenreeks vorming op Histon behandeld endotheliale cellen ten opzichte van onbehandelde endotheliale cellen. Dit protocol beschrijft een kwantitatieve, visuele en real-time de beoordeling van de activering van VWF-bloedplaatjes interacties in modellen van trombose en hemostase.

Introduction

Trombose is een belangrijke oorzaak van kindersterfte wereldwijd1 en kan ontwikkelen in reactie todysregulated bloedplaatjes activering en trombine generatie in de slagaders van beide veinsand. Plasma niveaus van VWF zijn een belangrijke regulator van de bloedstolling, waarbij lage niveaus (< 50%) resulteren in de bloedende aandoening bekend als von Willebrand (VWD) ziekte2 en een hoog niveau (> 150%) worden geassocieerd met een verhoogd risico op veneuze3 en arteriële4 trombose.

VWF is een glycoproteïne dat multimeric wordt gesynthetiseerd door megakaryocytes en endotheliale cellen en opgeslagen in de bloedplaatjes α-korrels en WPBs, respectievelijk. Bij hemostatische uitdaging, kan VWF vrijgesteld van endothelial WPBs ketting circulerende bloedplaatjes geactiveerd endotheliale cellen5 of blootgestelde collageen op het vaartuig muur6. Verankering van VWF naar endotheliale cellen is aangetoond te worden bemiddeld door P-selectine7 en integrine αvβ38. De volgende release van bloedplaatjes α-submodule winkels kan nog meer gelokaliseerde VWF concentraties om te stabiliseren bloedplaatjes-bloedplaatjes interacties voor de vorming van de plug van bloedplaatjes, de steiger die nodig zijn voor de voortplanting van de stolling cascade en fibrine afzetting. De bloedplaatjes-bindende activiteit van VWF wordt geregeld door de multimeric structuur, met hoog-moleculair gewicht multimeren bezitten meer hemostatische activiteit9,10. In omloop fungeert VWF ook als een drager voor de stolling factor VIII.

Vloeibare schuifspanning is een essentiële regulator van VWF fysiologie. Het ontbreken van shear stress bestaat VWF in een bolvormige vorm, verhulling van bindende domeinen voor bloedplaatjes glycoproteïne Ib hechting11. Wanneer schuifspanning aanwezig is, wordt de breukzijde voor een metalloprotease, een disintegrin en metalloprotease met Thrombospondine motief (ADAMTS13), blootgesteld. ADAMTS13 cleaves naakt en bloedplaatjes versierd VWF tekenreeksen voor het regelen van de grootte van de multimer, waardoor de hemostatische activiteit12.

VWF is een acutefase-eiwit, en talrijke stimuli, zoals hypoxie13, infectie14en proinflammatoire cytokines, is aangetoond dat het bemiddelen van VWF vrijlating uit de endotheliale cellen. Gelijkaardig aan andere inflammatoire agenten, extracellulaire histonen ook is gebleken dat voor het opwekken van systemische VWF versie in muizen15,16 en de activering van trombocyten in vitro17,18, 19. Dit werd getoond te zijn afhankelijk van Histon subtype, zoals verschillen in lysine en arginine inhoud functie15kan beïnvloeden. Onze doelstellingen van de studie om een stroom-kamer model voor het onderzoek naar de invloed van lysine-rijk (HK) en arginine-rijke (HR) Histon subtypen en secretagogues op endotheel VWF release en real-time bloedplaatjes vastleggen, potentiële vroege gebeurtenissen in ontsteking-geïnduceerde trombose.

Deze stroom kamer methodologie recapituleert in vivo interacties tussen subendothelial collageen, endotheliale cellen, VWF en bloedplaatjes in een in vitro -systeem dat is visuele, reproduceerbare en kwantificeerbare. De real-time beoordeling van alle aspecten van het traject dat VWF-bloedplaatjes interacties regelt, met inbegrip van WPB secretie, bloedplaatjes activering en VWF proteolyse voorziet. Studies van VWF onder gecontroleerde shear stress omstandigheden hebben gebruikt om te evalueren van de VWD mutaties die afbreuk doen aan de VWF release en bloedplaatjes-bindende functie20, WPB fysiologie21, en VWF decolleté door ADAMTS135. We gebruiken deze methode om te kwantificeren VWF-bloedplaatjes tekenreeks vorming als gevolg van een inflammatoire stimulans: extracellulaire histonen.

Protocol

Deze studies werden goedgekeurd door het onderzoek Ethics Board van Queen’s University, Canada. 1. endothelial cel stimulatie Collageen-vacht een 6-well weefselkweek plaat. 24 h op voorhand, jas een 6-well weefselkweek plaat bij 37 ° C met 1 mL van collageen buffer (50 µg Mo/mL rat staart collageen type 1 met 0,02 M ijsazijn). Was de putjes tweemaal met 2 mL van Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS).Opmerking: Platen kunnen worden verpak…

Representative Results

Om te beoordelen direct het effect van histones op VWF vrijlating uit de endotheliale cellen, blootgesteld we confluente BOECs serumvrij middellange met PMA (positieve controle), UH, HR en HK gedurende 2 uur. We toonden dat HK een 2-fold stijging van de VWF eiwit (VWF:Ag) in het medium van behandelde endotheliale cellen (Figuur 1 veroorzaakte). Interessant, toen BOECs werden gestimuleerd met UH en HR, er was minder VWF:Ag is gedetecteerd in het medium dan in …

Discussion

Terwijl de fysiologische relevantie van VWF-bloedplaatjes blijft controversieel vanwege hun snelle ontbinding bij de aanwezigheid van de VWF-splijten protease ADAMTS13 snaren, dienen ze als een kwantificeerbare in vitro model van bloedplaatjes rekrutering door VWF naar een website op die een trombose kan vormen in aanwezigheid van gelokaliseerde stijgingen van de Histon niveaus5. Bovendien, in pathologieën ADAMTS13 activiteit die ontbreekt als Trombotische trombocytopenische purpura (TTP…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Alison Michels is een ontvanger van een Frederick Banting en Charles Best Canada Graduate beurs van de Canadese instituten van gezondheid onderzoek (CIHR). Laura L. Swystun is de ontvanger een CIHR fellowship. David Lillicrap is de ontvanger van de Canada Research Chair in moleculaire hemostase. Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door een subsidie (MOP-97849) operationele CIHR.

Materials

Calf-thymus unfractionated histones (UH) Worthington Biochemical HLY Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus lysine-rich histones (HK) Sigma-Aldrich H5505 Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus arginine-rich histones (HR) Sigma-Aldrich H4830 Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139 Reconstituted in DMSO (20 mM)
Histamine Sigma-Aldrich H7125-1G Reconstituted in water (50 mg/mL)
3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6) Invitrogen D273 Reconstituted in methanol (20 mM)
Rabbit Anti-VWF Coating Antibody DAKO A0082 For VWF ELISA
Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated DAKO P0026 For VWF ELISA and histone-VWF binding assay
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates eBioscience 44-2404-21 For histone-VWF binding assay
Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates Thermo Scientific 3855 For VWF ELISA
Humate-P CSL Behring N/A Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex
Normal Reference Plasma Precision BioLogic CCNRP-05 For VWF ELISA standard curve
O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent Sigma-Aldrich P8287 Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162 For culturing and initial seeding of BOEC
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14025092
Rat-tail Collagen Type 1 Corning 354236
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media ThermoFisher Scientific 31985070 For endothelial cell stimulations
METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software Molecular Devices N/A
BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive BD Biosciences 366703
µ-Slide III 0.1 (flow chambers) Ibidi This product has been discontinued. We suggest using µ-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2
Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized Ibidi 10842
Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized Ibidi 10825
Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized Ibidi 10802
Blunted 18G Needle BD Biosciences 305180
20 mL syringes BD Biosciences 302830
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM N/A
Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope Quorum Technologies N/A
Image Processing Software ImageJ N/A
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics–2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
  2. Sadler, J. E. von Willebrand factor: two sides of a coin. J Thromb Haemost. 3 (8), 1702-1709 (2005).
  3. Koster, T., Blann, A. D., Briët, E., Vandenbroucke, J. P., Rosendaal, F. R. Role of clotting factor VIII in effect of von Willebrand factor on occurrence of deep-vein thrombosis. Lancet. 345 (8943), 152-155 (1995).
  4. Morange, P. E., et al. Endothelial Cell Markers and the Risk of Coronary Heart Disease: The Prospective Epidemiological Study of Myocardial Infarction (PRIME) Study. Circulation. 109 (11), 1343-1348 (2004).
  5. Dong, J. F., et al. ADAMTS-13 rapidly cleaves newly secreted ultralarge von Willebrand factor multimers on the endothelial surface under flowing conditions. Blood. 100 (12), 4033-4039 (2002).
  6. Ruggeri, Z. M. Von Willebrand factor, platelets and endothelial cell interactions. J Thromb Haemost. 1 (7), 1335-1342 (2003).
  7. Padilla, A., et al. P-Selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface P-selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface. Blood. 103 (6), 2150-2156 (2004).
  8. Huang, J., Roth, R., Heuser, J. E., Sadler, J. E. Integrin alpha v beta 3 on human endothelial cells binds von Willebrand factor strings under fluid shear stress. Blood. 113 (7), 1589-1598 (2009).
  9. Moake, J. L., Turner, N. A., Stathopoulos, N. A., Nolasco, L. H., Hellums, J. D. Involvement of large plasma von Willebrand Factor (vWF) multimers and unusually large vWF forms derived from endothelial cells in shear stress-induced platelet aggregation. J Clin Invest. 78 (6), 1456-1461 (1986).
  10. Federici, a. B., Bader, R., Pagani, S., Colibretti, M. L., De Marco, L., Mannucci, P. M. Binding of von Willebrand factor to glycoproteins Ib and IIb/IIIa complex: affinity is related to multimeric size. Br J Haematol. 73, 93-99 (1989).
  11. Goto, S., Salomon, D. R., Ikeda, Y., Ruggeri, Z. M. Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willebrand Factor to Platelets Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willeb. J Biol Chem. 270 (40), 23352-23361 (1995).
  12. Shim, K., Anderson, P. J., Tuley, E. A., Wiswall, E., Sadler, J. E. Platelet-VWF complexes are preferred substrates of ADAMTS13 under fluid shear stress. Blood. 111 (2), 651-657 (2008).
  13. Pinsky, D. J., et al. Hypoxia-induced exocytosis of endothelial cell weibel-palade bodies: A mechanism for rapid neutrophil recruitment after cardiac preservation. J Clin Invest. 97 (2), 493-500 (1996).
  14. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of Weibel-Palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cell Microbiol. 14 (2), 210-225 (2012).
  15. Michels, A., et al. Histones link inflammation and thrombosis through the induction of Weibel – Palade body exocytosis. J Thromb Haemost. 14 (11), 2274-2286 (2016).
  16. Brill, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (1), 136-144 (2012).
  17. Semeraro, F., et al. Extracellular histones promote thrombin generation through platelet-dependent mechanisms: involvement of platelet TLR2. Blood. 118 (7), 1952-1961 (2011).
  18. Ammollo, C. T., Semeraro, F., Xu, J., Esmon, N. L., Esmon, C. T. Extracellular histones increase plasma thrombin generation by impairing thrombomodulin-dependent protein C activation. J Thromb Haemost. 9 (9), 1795-1803 (2011).
  19. Carestia, A., Rivadeneyra, L., Romaniuk, M. A., Fondevila, C., Negrotto, S., Schattner, M. Functional responses and molecular mechanisms involved in histone-mediated platelet activation. Thromb Haemost. 110 (5), 1035-1045 (2013).
  20. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121 (14), 2762-2772 (2013).
  21. Ferraro, F., et al. Weibel-Palade body size modulates the adhesive activity of its von Willebrand Factor cargo in cultured endothelial cells. Sci Rep. 6, 32473 (2016).
  22. Starke, R. D., et al. Cellular and molecular basis of von Willebrand disease: studies on blood outgrowth endothelial cells. Blood. 121 (14), 2773-2784 (2013).
  23. Ormiston, M. L., et al. Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood. J Vis Exp. (106), e53384 (2015).
  24. Xu, J., et al. Extracellular histones are major mediators of death in sepsis. Nat Med. 15 (11), 1318-1321 (2009).
  25. Abrams, S. T., et al. Circulating histones are mediators of trauma-associated lung injury. Am J Respir Crit Care Med. 187 (2), 160-169 (2013).
  26. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Choi, H., Moake, J. L., Dong, J. F. Platelets adhered to endothelial cell-bound ultra-large von Willebrand factor strings support leukocyte tethering and rolling under high shear stress. J Thromb Haemost. 3 (3), 562-570 (2005).
  27. Hewlett, L., et al. Temperature-dependence of weibel-palade body exocytosis and cell surface dispersal of von willebrand factor and its propolypeptide. PLoS ONE. 6 (11), (2011).
  28. Lam, F. W., Cruz, M. A., Parikh, K., Rumbaut, R. E. Histones stimulate von Willebrand factor release in vitro and in vivo. Haematologica. 101 (7), e277-e279 (2016).
  29. Zheng, Y., Chen, J., López, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat Commun. 6 (7858), (2015).
  30. Ward, C. M., Tetaz, T. J., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Binding of the von Willebrand factor A1 domain to histone. Thromb Res. 86 (6), 469-477 (1997).
  31. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand-factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  32. De Ceunynck, K., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K. Unwinding the von Willebrand factor strings puzzle. Blood. 121 (2), 270-277 (2013).
  33. Petri, B., et al. von Willebrand factor promotes leukocyte extravasation. Blood. 116 (22), 4712-4719 (2010).
  34. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), 1-13 (2012).
  35. Wang, J. W., et al. Formation of platelet-binding von Willebrand factor strings on non-endothelial cells. J Thromb Haemost. 10 (10), 2168-2178 (2012).
  36. Yamamoto, K., de Waard, V., Fearns, C., Loskutoff, D. J. Tissue Distribution and Regulation of Murine von Willebrand Factor Gene Expression In Vivo. Blood. 92 (8), 2791-2801 (1998).
  37. Shahani, T., Lavend’homme, R., Luttun, A., Saint-Remy, J. M., Peerlinck, K., Jacquemin, M. Activation of human endothelial cells from specific vascular beds induces the release of a FVIII storage pool. Blood. 115 (23), 4902-4909 (2010).
  38. Wu, S., et al. CaV3.1 (α1G) T-type Ca2+ channels mediate vaso-occlusion of sickled erythrocytes in lung microcirculation. Circ Res. 93 (4), 346-353 (2003).
  39. Knop, M., Gerke, V. Ca2+ -regulated secretion of tissue-type plasminogen activator and von Willebrand factor in human endothelial cells. Biochim Biophys Acta. 1600 (1-2), 162-167 (2002).
  40. Vischer, U., Wollheim, C. Epinephrine induces von Willebrand factor release from cultured endothelial cells: involvement of cyclic AMP-dependent signalling in exocytosis. Thromb Haemost. 77 (6), 1182-1188 (1997).
  41. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  42. Kumar, R. A., Dong, J. F., Thaggard, J. A., Cruz, M. A., López, J. A., McIntire, L. V. Kinetics of GPIbalpha-vWF-A1 tether bond under flow: effect of GPIbalpha mutations on the association and dissociation rates. Biophys J. 85 (6), 4099-4109 (2003).
  43. Lipowsky, H. H., Usami, S., Chien, S. In vivo measurements of "apparent viscosity" and microvessel hematocrit in the mesentery of the cat. Microvasc Res. 19 (3), 297-319 (1980).
  44. De Ceunynck, K., et al. Local elongation of endothelial cell-anchored von Willebrand factor strings precedes ADAMTS13 protein-mediated proteolysis. J Biol Chem. 286 (42), 36361-36367 (2011).
  45. Coburn, L. A., Damaraju, V. S., Dozic, S., Eskin, S. G., Cruz, M. A., McIntire, L. V. GPIbalpha-vWF rolling under shear stress shows differences between type 2B and 2M von Willebrand disease. Biophys J. 100 (2), 304-312 (2011).
  46. Dong, J. F., et al. Magnesium maintains endothelial integrity, up-regulates proteolysis of ultra-large von Willebrand factor, and reduces platelet aggregation under flow conditions. Thromb Haemost. 99 (3), 586-593 (2008).

Tags

Keywords: Von Willebrand FactorVWF-platelet String FormationFlow Chamber ModelCollagenEndothelial CellsPlateletsSecretagoguesIn VitroMicroscopySyringe Pump
check_url/kr/55917?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. J. Vis. Exp. (126), e55917, doi:10.3791/55917 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image