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의학

Untersuchung von Willebrand Faktor Pathophysiologie mit einem Flow-Kammer-Modell des von Willebrand-Faktor-Thrombozyten String Bildung

Published: August 14, 2017
doi:
10.3791/55917
, , , ,
1Department of Pathology and Molecular Medicine,Queen’s University, 2Department of Medicine,Queen’s University

Summary

In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur Bestimmung der endothelialen von Willebrand Faktor Release und das anschließende Plättchen erfassen unter Fluid Schubspannung in Reaktion auf entzündliche Reize mit einer in-Vitro -Fluss-Kammer-System.

Abstract

Von-Willebrand-Faktor (VWF) ist ein Multimeric Glykoprotein Gerinnungsfaktor vermittelt, die Plättchen Adhäsion und Aggregation an Standorten von Endothelschäden und Faktor VIII in der Zirkulation führt. VWF ist durch endothelial Zellen synthetisiert und wird entweder konstitutiv in das Plasma abgegeben oder in speziellen Organellen, Weibel-Palade Körper (WPBs), genannt für bedarfsgesteuerte Freigabe in Erwiderung auf blutstillende Herausforderung gespeichert. Gerinnungsfördernden und proinflammatorischen Reize können schnell WPB Exozytose und VWF Freisetzung auslösen. Die Mehrheit der VWF veröffentlicht von Endothelzellen zirkuliert im Plasma; jedoch ist ein Teil der VWF an der Oberfläche der Endothelzellen verankert. Unter Bedingungen der physiologischen Scherung kann Endothelzellen verankert VWF binden an Thrombozyten, bilden eine VWF-Thrombozyten-Zeichenfolge, die die Nidus Thrombusbildung darstellen kann. Ein Flow-Kammer-System kann verwendet werden, um visuell zu beobachten, die Freisetzung von VWF aus Endothelzellen und das anschließende Plättchen in einer Art und Weise zu erfassen, die reproduzierbar und relevant für die Pathophysiologie der VWF-vermittelten Thrombusbildung. Mit dieser Methodik, Endothelzellen sind kultiviert in einem Strömungsraum und anschließend mit Secretagogues induzieren WPB Exozytose stimuliert. Gewaschene Thrombozyten sind dann über die aktivierte Endothel durchblutet. Die Plättchen werden aktiviert und anschließend binden an länglichen VWF-Zeichenfolgen in die Richtung der Flüssigkeitsströmung. Verwendung von extrazellulären Histone als gerinnungsfördernden und proinflammatorischen Anregung, beobachteten wir erhöhten VWF-Thrombozyten Zeichenfolge Bildung auf Histon-behandelten endothelial Zellen im Vergleich zu unbehandelten Endothelzellen. Dieses Protokoll beschreibt eine quantitative, visuelle und Echtzeit-Bewertung der Aktivierung von VWF-Thrombozyten-Interaktionen in den Modellen der Thrombose und Hämostase.

Introduction

Thrombose ist eine führende Ursache von Sterblichkeit weltweit1 und Antwort Todysregulated Thrombozyten Aktivierung und Thrombin Generation in beiden Veinsand Arterien entwickeln kann. Plasmaspiegel von VWF sind ein wichtiger Regulator der Blutgerinnung, wobei niedrige Konzentrationen (< 50 %) führen, die Störung der Blutgerinnung bekannt als von Willebrand Krankheit (VWD)2 und ein hohes Maß (> 150 %) sind verbunden mit einem erhöhten Risiko von venösen3 und arterielle4 Thrombose.

VWF ist ein Multimeric Glykoprotein von Megakaryozyten und Endothelzellen synthetisiert und gespeichert in Thrombozyten α-Granula und WPBs, beziehungsweise. Bei blutstillende Herausforderung kann VWF von endothelialen WPBs, zirkulierende Thrombozyten aktiviert Endothelzellen5 oder freiliegende Kollagen auf dem Schiff Wand6Leine freigegeben werden. Verankerung der VWF an Endothelzellen nachweislich durch P-Selektin7 und Integrin αvβ38vermittelt werden. Die anschließende Freisetzung von Thrombozyten α-Granulat Geschäften kann lokalisierte VWF-Konzentrationen zur Stabilisierung der Thrombozyten-Thrombozyten Interaktionen für Thrombozyten Stecker Bildung, das Gerüst für die Ausbreitung der Koagulation Kaskade und Fibrin benötigt weiter erhöhen. Ablagerung. Die Thrombozyten-Bindung-Aktivität des VWF ist durch seine Multimeric Struktur mit hochmolekularen Gewicht Multimere besitzen größere blutstillende Aktivität9,10geregelt. Im Umlauf fungiert VVS auch als Träger für die Gerinnung Faktor VIII.

Fluid Scherspannung ist ein wesentlicher Regulator der VWF-Physiologie. In Ermangelung der Schubspannung existiert VWF in eine kugelige Form verbergen Bindung Domains für Thrombozyten-Glykoprotein Ib Adhäsion11. Wenn Schubspannung vorhanden ist, ist die Spaltstelle für eine Metalloprotease, ein Disintegrin und Metalloprotease mit Thrombospondin-Motiv (ADAMTS13) ausgesetzt. ADAMTS13 spaltet nackte und Thrombozyten eingerichtet VWF Zeichenfolgen zur Regulierung der Multimer Größe, wodurch seine blutstillende Aktivität12.

VWF ist ein akute-Phase-Protein, und zahlreiche Reize, einschließlich Hypoxie13, Infektion14und proinflammatorischen Zytokinen, haben gezeigt, dass VWF Freisetzung aus Endothelzellen zu vermitteln. Ähnlich wie andere entzündliche Agenten, extrazelluläre Histone haben auch gezeigt, dass systemische VWF Freisetzung in Mäusen15,16 und die Aktivierung von Thrombozyten in-vitro-17,18, induzieren 19. dies gezeigt wurde abhängig von Histon-Subtyp, da Unterschiede im Lysin und Arginin Inhalt Funktion15beeinflussen kann. Unsere Studie zielt darauf ab, eine Strömungsraum etablieren zu modellieren, um den Einfluss von Lysin-Rich (HK) zu untersuchen und reich an Arginin (HR) Histon Untertypen und Secretagogues auf endothelialer VWF Freisetzung und Echtzeit-Plättchen erfassen, mögliche frühe Ereignisse in Entzündung-induzierte Thrombose.

Dieser Fluss Kammer Methodik rekapituliert in Vivo Interaktionen zwischen Subendothelial Kollagen, Endothelzellen, VWF und Thrombozyten in eine in-vitro- System, das visuelle, reproduzierbare und quantifizierbar ist. Es ermöglicht die Echtzeit-Bewertung aller Aspekte des Pfades, der VWF-Thrombozyten Interaktionen, darunter WPB-Sekretion, Thrombozyten Aktivierung und VWF Proteolyse reguliert. Studien von VWF unter kontrollierten Schubspannung Bedingungen wurden zur VWD Mutationen zu bewerten, die VWF Freisetzung und Thrombozyten-bindende Funktion20, WPB Physiologie21und VWF Spaltung beeinträchtigen von ADAMTS135. Wir verwenden diese Methode, um VWF-Thrombozyten Zeichenfolge Bildung als Folge einer Entzündungsreiz zu quantifizieren: extrazelluläre Histone.

Protocol

Diese Studien wurden von der Research Ethics Board der Königin University, Kanada genehmigt. (1) Endothelzellen Stimulation Kollagen-Mantel einer Gewebekultur 6-Well-Platte. 24 Stunden im Voraus, Mantel einer Gewebekultur 6-Well Platte bei 37 ° C mit 1 mL Kollagen Puffer (50 µg/mL Ratte Schweif Kollagen Typ 1 mit 0,02 M Eisessig). Waschen Sie die Brunnen zweimal mit 2 mL von Hank es ausgewogen Salz Lösung (HBSS).Hinweis: Platten können …

Representative Results

Um die Wirkung der Histone auf VWF Freisetzung aus Endothelzellen direkt zu beurteilen, wir konfluierende BOECs serumfreien Medium mit PMA (Positivkontrolle), UH, HR und HK für 2 h ausgesetzt. Wir haben gezeigt, dass HK eine 2-fache Erhöhung im VWF-Protein (VWF:Ag) in das Medium der behandelten Endothelzellen (Abbildung 1 induziert). Interessant ist, wenn Sie BOECs mit UH und HR angeregt wurden, war es weniger VWF:Ag im Medium als im unbehandelten Zustand e…

Discussion

Während die physiologische Bedeutung der VWF-Thrombozyten aufgrund ihrer schnellen Auflösung im Beisein der VWF-Spaltung Protease ADAMTS13 umstritten bleibt Streicher, dienen sie als quantifizierbare in Vitro Modell der Thrombozyten Rekrutierung von VWF an einen Standort am bilden ein Thrombus kann in Gegenwart von lokalisiert Anstieg Histon Level5. Zudem fehlen ADAMTS13 Aktivität-solch als thrombotische thrombozytopenische Purpura (TTP) – oder entzündliche Mikroumgebungen – Pathologi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Alison Michels ist ein Empfänger eines Frederick Banting und Charles Best Kanada Graduate Stipendium von Canadian Institute der Gesundheit Forschung (CIHR). Laura L. Swystun ist der Empfänger ein CIHR Stipendium. David Lillicrap ist der Empfänger ein Canada Research Chair in molekularen Blutstillung. Diese Studie wurde zum Teil durch eine CIHR Zuschuss (MOP-97849) Betrieb finanziert.

Materials

Calf-thymus unfractionated histones (UH) Worthington Biochemical HLY Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus lysine-rich histones (HK) Sigma-Aldrich H5505 Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus arginine-rich histones (HR) Sigma-Aldrich H4830 Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139 Reconstituted in DMSO (20 mM)
Histamine Sigma-Aldrich H7125-1G Reconstituted in water (50 mg/mL)
3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6) Invitrogen D273 Reconstituted in methanol (20 mM)
Rabbit Anti-VWF Coating Antibody DAKO A0082 For VWF ELISA
Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated DAKO P0026 For VWF ELISA and histone-VWF binding assay
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates eBioscience 44-2404-21 For histone-VWF binding assay
Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates Thermo Scientific 3855 For VWF ELISA
Humate-P CSL Behring N/A Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex
Normal Reference Plasma Precision BioLogic CCNRP-05 For VWF ELISA standard curve
O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent Sigma-Aldrich P8287 Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162 For culturing and initial seeding of BOEC
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14025092
Rat-tail Collagen Type 1 Corning 354236
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media ThermoFisher Scientific 31985070 For endothelial cell stimulations
METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software Molecular Devices N/A
BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive BD Biosciences 366703
µ-Slide III 0.1 (flow chambers) Ibidi This product has been discontinued. We suggest using µ-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2
Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized Ibidi 10842
Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized Ibidi 10825
Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized Ibidi 10802
Blunted 18G Needle BD Biosciences 305180
20 mL syringes BD Biosciences 302830
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM N/A
Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope Quorum Technologies N/A
Image Processing Software ImageJ N/A
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Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. J. Vis. Exp. (126), e55917, doi:10.3791/55917 (2017).
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