Localisation des gènes des récepteurs odorants dans les antennes acridiennes par ARN<em> In Situ</em> Hybridation
Summary
Cet article décrit un protocole d'hybridation in situ ARN détaillé et hautement efficace, en particulier pour les gènes de récepteur à l'odorant (OR) à faible niveau, ainsi que d'autres gènes, dans les antennes d'insectes utilisant des sondes marquées par de la digoxigénine (DIG) ou biotinées.
Abstract
Les insectes ont développé des systèmes sophistiqués d'accueil olfactif pour détecter les signaux chimiques exogènes. Ces signaux chimiques sont transduits par Olfactory Receptor Neurons (ORN) logés dans des structures capillaires, appelées chemosensilla, des antennes. Sur les membranes des ORN, on pense que les récepteurs à l'odorant (OR) sont impliqués dans le codage des odeurs. Ainsi, être capable d'identifier les gènes localisés dans les ORN est nécessaire pour reconnaître les gènes OU, et constitue une base fondamentale pour d'autres études fonctionnelles in situ . Les niveaux d'expression d'ARN d' OR spécifiques dans les antennes d'insectes sont très faibles et la conservation des tissus d'insectes pour l'histologie est difficile. Ainsi, il est difficile de localiser un OR à un type spécifique de sensilla en utilisant l'hybridation in situ de l' ARN. Dans cet article, un protocole d'hybridation in situ ARN détaillé et très efficace, en particulier pour les gènes OU à faible expression des insectes, est introduit. En outre, un OR spécifique Gène waS identifiés en effectuant des expériences d'hybridation in situ fluorescentes à double couleur en utilisant un gène de récepteur coextratifiant, Orco , comme marqueur.
Introduction
Les antennes à insectes, qui sont les organes chimiosensibles les plus importants, sont recouvertes de nombreuses structures capillaires – appelées sensilla – qui sont innervées par les neurones récepteurs olfactifs (ORN). Sur la membrane des ORN d'insectes, les récepteurs odorants (OR), un type de protéine contenant sept domaines transmembranaires, sont exprimés avec un corecepteur (ORco) pour former un hétérother qui fonctionne comme un canal ionique 1 , 2 , 3 odorant-gated. Différentes OR répondent à différentes combinaisons de composés chimiques 4 , 5 , 6 .
Les langoustes ( Locusta migratoria ) s'appuient principalement sur des indices olfactifs pour déclencher des comportements importants 7 . Les OR sont des facteurs clés pour la compréhension des mécanismes moléculaires olfactifs. Localiser un gène spécifique OR acridien au neurone d'unLe type sensillum morphologiquement spécifique par ARN In Situ Hybridization (RNA ISH) est la première étape dans l'exploration de la fonction OR.
L'ARN ISH utilise une sonde d'ARN complémentaire marquée pour mesurer et localiser une séquence d'ARN spécifique dans une section de tissu, des cellules ou des montures entières in situ , fournissant des informations sur les processus physiologiques et la pathogenèse de la maladie. Les sondes d'ARN marquées à la digoxigénine (DIG-marquées) et à la biotine ont été largement utilisées dans l'hybridation d'ARN. L'étiquetage de l'ARN avec la digoxigénine-11-UTP ou la biotine-16-UTP peut être préparé par transcription in vitro avec des ARN polymérases SP6 et T7. Les sondes d'ARN marquées par DIG et biotine présentent les avantages suivants: non radioactifs; sûr; stable; très sensible; Très spécifique; Et facile à produire en utilisant la PCR et la transcription in vitro . Les sondes d'ARN marquées par des DIG et des biotines peuvent être détectées de manière chromogène et fluorescente. Les sondes d'ARN marquées par DIG peuvent être détectées avec de l'anti-digoxigénine AlkaliNe phosphatase (AP) – anticorps conjugués qui peuvent être visualisés soit avec des substrats chimioluminescents très sensibles, chlorure de nitroblue tétrazolium / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine (NBT / BCIP) en utilisant un microscope optique ou avec 2 -hydroxy-3-naphtoïque-2'-phénylanilide phosphate (HNPP) couplé au sel de chlorure de hemi-zinc de 4-chloro-2-méthylbenzènediazonium (Fast Red) en utilisant un microscope confocal. Les sondes d'ARN marquées par la biotine peuvent être détectées avec des anticorps conjugués anti-biotine et streptavidine avec des peroxydases de pistax (HRP) qui peuvent être visualisés avec des fluorescéine-tyramides à l'aide d'un microscope confocal. Ainsi, une hybridation fluorescente in situ à deux couleurs peut être effectuée pour détecter deux gènes cibles dans une tranche en utilisant des sondes d'ARN marquées par DIG et biotine.
L'ARN ISH avec des sondes marquées par DIG et / ou biotine a été utilisé avec succès pour localiser des gènes liés à l'olfactif, tels que l' OR , le récepteur ionotropique, la protéine de liaison aux odeursEt la protéine membranaire des neurones sensoriels, dans les antennes d'insectes, mais sans s'y limiter, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria et la crique du désert Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Cependant, il existe deux défis importants lors de l'exécution de l'ARN ISH pour les OR d'insecte: (1) Les gènes OU (sauf ORco ) sont exprimés à des niveaux faibles et seulement dans quelques cellules, ce qui rend la détection du signal très difficile et (2) la préservation des tissus d'insectes pour L'histologie, de sorte que la morphologie est préservée et que le bruit de fond est faible, peut être difficile. Dans cet article, un protocole détaillé et efficace décrivant l'ARN ISH pour la localisation des gènes OU dans les insectesDes antennes sont présentées, y compris la détection chromogène et l'amplification du signal Tyramide (TSA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il est difficile d'effectuer l'ARN ISH pour localiser les gènes OU dans les antennes d'insectes car les niveaux d'expression des gènes OR, à l'exception de l' ORco , sont très faibles et la conservation des tranches histologiques d'antennes d'insectes est très difficile. En outre, la détection TSA est également très délicate. Pour résoudre ces problèmes, les mesures suivantes devraient être prises. Les antennes sont sélectionnées à partir de criquets adultes nouvel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par une subvention de la National Natural Science Foundation of China (No.31472037). La mention de noms commerciaux ou de produits commerciaux dans cet article est uniquement destinée à fournir des informations spécifiques et n'implique pas une recommandation.
Materials
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12%acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5%NaCl |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14mM KH2PO4 |
| 10×phosphate buffer saline (pH7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80mM Na2HPO4 |
| 10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1M Tris-Base |
| 10×Tris buffered saline (pH7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH9.5 TSA detection pH8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| 4% paraformaldehyde solution (pH9.5) | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in Tris buffered saline | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/ml anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in Tris buffered saline | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/ml yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/ml herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10mg/ml) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25mg/ml) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
References
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