Tomographie médiée par fluorescence pour la détection et la Quantification de l’Inflammation intestinale Murine axés sur les macrophages
Summary
Spécifique à la cible sondes représentent un outil innovant pour l’analyse des mécanismes moléculaires, comme expression de la protéine dans divers types de maladie (p. ex., inflammation, infection et tumorigenèse). Dans cette étude, les auteurs décrivent une évaluation quantitative de tomographie tridimensionnelle d’infiltration de macrophages intestinaux dans un modèle murin de colite en utilisant la tomographie de F4/80-spécifique induite par fluorescence.
Abstract
Les modèles murins de la maladie sont indispensables à la recherche scientifique. Cependant, nombreux outils de diagnostic telles que l’endoscopie ou d’imagerie tomographique ne sont pas employés couramment dans des modèles animaux. Afficheurs expérimentales classiques reposent souvent sur des analyses post-mortem et ex vivo , qui empêchent les examens de suivi intra-individuelle et augmentent le nombre d’animaux d’étude nécessaires. Fluorescence induite par la tomographie permet l’évaluation non invasive, répétitive, quantitative tridimensionnelle des sondes fluorescentes. Il est très sensible et permet l’utilisation de fabricants de moléculaires, qui permet la détection spécifique et la caractérisation des cibles moléculaires distinctes. En particulier, les sondes ciblées représentent un outil innovant permettant d’analyser l’expression des gènes d’activation et de protéine dans l’inflammation, maladie auto-immune, infection, maladies vasculaires, la migration cellulaire, tumorigenèse, etc.. Dans cet article, nous fournissons des instructions détaillées sur cette technologie d’imagerie sophistiquée de in vivo de détection et de caractérisation de l’inflammation (c.-à-d., infiltration de macrophages F4/80-positif) dans un modèle murin largement utilisé de inflammation intestinale. Cette technique peut également être utilisée dans d’autres domaines de recherche, comme suivi de cellule ou des cellules souches immunitaire.
Introduction
Modèles animaux sont largement utilisés dans la recherche scientifique, et de nombreuses méthodes non invasives existent pour moniteur activité de la maladie et de la vitalité, tels que la quantification des changements de poids corporel ou l’analyse de sang, urine et les fèces. Cependant, ce sont uniquement les paramètres de substitution indirecte qui sont également sujettes à la variabilité interindividuelle. Ils doivent souvent être complétées par des analyses post-mortem du spécimen de tissu, ce qui empêche la série observation aux périodes répétitives et dirigent observation de physiologique ou pathologique traite in vivo. Des techniques d’imagerie sophistiquées de petits animaux ont émergé, y compris les traverses sectionnelle imagerie, imagerie optique et endoscopie, qui permet la visualisation directe de ces processus et permet également aux analyses répétitives du même animaux1 , 2 , 3. en outre, la possibilité de surveiller continuellement divers États de la maladie chez le même animal peut diminuer le nombre d’animaux nécessaires, qui pourraient être souhaitables dans une perspective éthique animale.
Plusieurs techniques d’imagerie optiques existent pour l’imagerie de fluorescence in vivo . A l’origine, l’imagerie confocale a été employé pour étudier la surface et de subsurface événements fluorescent4,5. Récemment, cependant, les systèmes tomographiques qui permettent des évaluations quantitatives dimensions des tissus ont été développés6. Ceci a été accompli grâce au développement de sondes fluorescentes qui émettent de la lumière dans le spectre de proche infrarouge (NIR), offrant la faible absorption des détecteurs sensibles et sources de lumière monochromatique7. Alors que les techniques d’imagerie traditionnelle vues en coupe, comme la tomodensitométrie (TDM), imagerie de résonance magnétique (IRM) ou ultrasons (US), s’appuient principalement sur les paramètres physiques et visualiser la morphologie, imagerie optique peut fournir des renseignements supplémentaires sur les mécanismes moléculaires sous-jacents à l’aide de fluorescence endogène ou exogène sondes8.
Progrès en biologie moléculaire ont permis de faciliter la génération de sondes moléculaires fluorescentes intelligentes et ciblées pour un nombre croissant de cibles. Par exemple, médiée par les récepteurs l’absorption et la distribution dans une zone cible donnée peuvent être visualisées à l’aide d’anticorps marqués dérivé carbocyanine9. L’abondance des anticorps disponibles, qui peuvent être étiquetés à fonctionner comme des traceurs spécifiques dans des endroits inaccessibles autrement du corps, donne un aperçu sans précédent à des processus moléculaires et cellulaires dans les modèles de la tumorigenèse et neurodégénératives, maladies cardiovasculaires, inflammatoires et immunologiques7.
Dans cette étude, nous décrivons l’utilisation de la fluorescence induite par la tomographie dans un modèle murin de colite. Dextran sulfate de sodium (DSS)-colite induite est un modèle de souris induite chimiquement standard d’inflammation intestinale qui ressemble à inflammatoires de l’intestin (IBD) la maladie10. Il est particulièrement utile évaluer la contribution du système immunitaire inné pour le développement de l’inflammation intestinale11. Étant donné que le recrutement, l’activation et l’infiltration de monocytes et macrophages représentent des étapes cruciales dans la pathogenèse de l’EIA, visualisation de leur recrutement et de la cinétique d’infiltration sont essentiels à la surveillance, par exemple, l’effet de substances thérapeutiques potentielles dans un paramètre précliniques12. Nous décrivons l’induction d’une colite DSS et démontrer la caractérisation induite par la tomographie de l’infiltration de macrophages dans la muqueuse de l’intestin en utilisant la fluorescence moléculaire tomographie pour la visualisation spécifique du marqueur de monocytes/macrophages F4/80 13. en outre, nous illustrons les procédures auxiliaires et supplémentaires, tels que les anticorps étiquetage ; le montage expérimental ; et l’analyse et l’interprétation des images obtenues, en corrélation avec des lectures classiques tels que les indices de l’activité de la maladie, flow cytometry et analyse histologique et immunohistochimique. Nous discutons des limites de cette technique et les comparaisons avec les autres modalités d’imagerie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que les techniques d’imagerie médicale ont rapidement évolué ces dernières années, nous sommes encore limités dans notre capacité à détecter des processus inflammatoires ou tumeurs, ainsi que d’autres maladies, dans leurs premiers stades de développement. Cependant, c’est crucial pour la croissance tumorale compréhension, invasion, ou développement de métastases et des processus cellulaires dans le développement de troubles inflammatoires et maladies dégénératives, cardiovasculaires et immunol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Mme Sonja Dufentester, Mme Elke Weber et Mme Klaudia Niepagenkämper pour son aide technique.
Materials
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
| Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
| Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
| Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
References
- Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
- Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging. Eur J Cancer. 38 (16), 2173-2188 (2002).
- Bettenworth, D., et al. Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation. J Nucl Med. 54 (5), 748-755 (2013).
- Vowinkel, T., et al. Apolipoprotein A-IV inhibits experimental colitis. J Clin Invest. 114 (2), 260-269 (2004).
- Korlach, J., Schwille, P., Webb, W. W., Feigenson, G. W. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (15), 8461-8466 (1999).
- Ntziachristos, V., Tung, C. H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nat Med. 8 (7), 757-760 (2002).
- Ntziachristos, V., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging. Eur Radiol. 13 (1), 195-208 (2003).
- Ntziachristos, V., Bremer, C., Graves, E. E., Ripoll, J., Weissleder, R. In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes. Mol Imaging. 1 (2), 82-88 (2002).
- Ballou, B., et al. Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother. 41 (4), 257-263 (1995).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kawada, M., Arihiro, A., Mizoguchi, E. Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 13 (42), 5581-5593 (2007).
- Nowacki, T. M., et al. The 5A apolipoprotein A-I (apoA-I) mimetic peptide ameliorates experimental colitis by regulating monocyte infiltration. Br J Pharmacol. 173 (18), 2780-2792 (2016).
- Hansch, A., et al. In vivo imaging of experimental arthritis with near-infrared fluorescence. Arthritis Rheum. 50 (3), 961-967 (2004).
- Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses. J Vis Exp. (113), (2016).
- Diaz-Granados, N., Howe, K., Lu, J., McKay, D. M. Dextran sulfate sodium-induced colonic histopathology, but not altered epithelial ion transport, is reduced by inhibition of phosphodiesterase activity. Am J Pathol. 156 (6), 2169-2177 (2000).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD. J Vis Exp. (60), e3678 (2012).
- Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
- Kojouharoff, G., et al. Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reduces inflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice. Clin Exp Immunol. 107 (2), 353-358 (1997).
- Sunderkotter, C., et al. Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response. J Immunol. 172 (7), 4410-4417 (2004).
- Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S. Molecular imaging in drug development. Nat Rev Drug Discov. 7 (7), 591-607 (2008).
- Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging. Nat Biotechnol. 23 (3), 313-320 (2005).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
- Stuker, F., Ripoll, J., Rudin, M. Fluorescence molecular tomography: principles and potential for pharmaceutical research. Pharmaceutics. 3 (2), 229-274 (2011).
- Beziere, N., Ntziachristos, V. Optoacoustic imaging: an emerging modality for the gastrointestinal tract. Gastroenterology. 141 (6), 1979-1985 (2011).
- Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon. Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).
- Ungar, B., Kopylov, U. Advances in the development of new biologics in inflammatory bowel disease. Ann Gastroenterol. 29 (3), 243-248 (2016).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn’s disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
- Coskun, M., Vermeire, S., Nielsen, O. H. Novel Targeted Therapies for Inflammatory Bowel Disease. Trends Pharmacol Sci. , (2016).
- Vermeire, S., et al. The mucosal addressin cell adhesion molecule antibody PF-00547,659 in ulcerative colitis: a randomised study. Gut. 60 (8), 1068-1075 (2011).
- Terai, T., Nagano, T. Small-molecule fluorophores and fluorescent probes for bioimaging. Pflugers Arch. 465 (3), 347-359 (2013).
- Ren, W., et al. Dynamic Measurement of Tumor Vascular Permeability and Perfusion using a Hybrid System for Simultaneous Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging. Mol Imaging Biol. 18 (2), 191-200 (2016).
- Ale, A., Ermolayev, V., Deliolanis, N. C., Ntziachristos, V. Fluorescence background subtraction technique for hybrid fluorescence molecular tomography/x-ray computed tomography imaging of a mouse model of early stage lung cancer. J Biomed Opt. 18 (5), 56006 (2013).
- Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. Br J Pharmacol. 157 (2), 220-233 (2009).
- Faust, A., Hermann, S., Schafers, M., Holtke, C. Optical imaging probes and their potential contribution to radiotracer development. Nuklearmedizin. 55 (2), 51-62 (2016).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), G544-G551 (1998).
