Tomografía mediada por fluorescencia para la detección y cuantificación de la inflamación Intestinal murina relacionadas con macrófagos
Summary
Sondas específicas de objetivo representan una herramienta innovadora para el análisis de los mecanismos moleculares, como la expresión de proteínas en diversos tipos de enfermedad (p. ej., inflamación, infección y tumorigenesis). En este estudio, describimos una evaluación tomográfica tridimensional cuantitativa de la infiltración de macrófagos intestinales en un modelo murino de colitis con F4/80-específica mediada por fluorescencia tomografía.
Abstract
Modelos murinos de enfermedad son indispensables para la investigación científica. Sin embargo, muchas herramientas de diagnostico como la endoscopia o la proyección de imagen tomográfica no se emplean rutinariamente en modelos animales. Lecturas experimentales convencionales a menudo se basan en análisis post mortem y ex vivo , que evitar las citas de seguimiento intra individuales y aumentan el número de animales de estudio necesitada. Tomografía mediado fluorescencia permite la evaluación no invasiva, repetitiva, cuantitativa, tridimensional de sondas fluorescentes. Es muy sensible y permite el uso de los fabricantes de moleculares, que permite la detección específica y la caracterización de distintas dianas moleculares. En particular, las puntas de prueba específicas representan una herramienta innovadora para el análisis de genes de activación y de la proteína en inflamación, enfermedades autoinmunes, infección, enfermedad vascular, migración celular, tumorigénesis, etcetera. En este artículo, ofrecemos instrucciones paso a paso en esta sofisticada tecnología de proyección de imagen para el en vivo detección y caracterización de la inflamación (es decir, la infiltración de macrófagos F4/80-positivo) en un modelo murino utilizado de inflamación intestinal. Esta técnica podría utilizarse también en otras áreas de investigación, como seguimiento de la célula o células madre inmune.
Introduction
Los modelos animales son ampliamente utilizados en la investigación científica, y existen muchos procedimientos no invasivos para monitor actividad de la enfermedad y la vitalidad, como la cuantificación de los cambios de peso o el análisis de sangre, orina y heces. Sin embargo, estas son sólo parámetros de sustituto indirecto que también están sujetos a variabilidad interindividual. Con frecuencia deben complementarse análisis post mortem de muestras de tejido, que impide la observación serial en momentos repetitivos y dirigir los procesos de observación del fisiológico o patológico en vivo. Sofisticadas técnicas de imagen pequeños animales han surgido, incluyendo la proyección de imagen seccional, imágenes ópticas y endoscopia, que permite la visualización directa de estos procesos y también permite análisis repetitivos de los mismos animales1 , 2 , 3. Además, la posibilidad de repetitivas controlar diferentes Estados de la enfermedad en el mismo animal podría disminuir el número de animales necesarios, que podría ser deseable desde un punto de vista de la ética animal.
Existen varias técnicas de proyección de imagen ópticas en vivo imágenes de fluorescencia. Originalmente, la proyección de imagen confocal fue empleada para estudiar la superficie y subsuperficie eventos fluorescente4,5. Recientemente, sin embargo, sistemas tomográficos que permiten la evaluación cuantitativa del tejido tridimensional han sido desarrollados6. Esto se ha logrado mediante el desarrollo de sondas fluorescentes que emiten luz en el espectro de infrarrojo cercano (NIR), con baja absorción, detectores sensibles y fuentes de luz monocromáticas7. Mientras que las técnicas de imagen cross-sectioning tradicional, tales como la tomografía computada (CT), imágenes por resonancia magnética (MRI) o ultrasonido (US), en su mayoría dependen de parámetros físicos y visualizar la morfología, la proyección de imagen óptica puede proporcionar información adicional sobre los procesos moleculares subyacentes utilizando fluorescentes endógenos o exógenos sondas de8.
Avances en biología molecular han contribuido a facilitar la generación de sondas moleculares fluorescentes inteligentes y específicas para un número creciente de objetivos. Por ejemplo, captación mediada por receptor y la distribución en un área dada se pueden visualizar utilizando carbocyanine anticuerpos etiquetados derivado9. La abundancia de anticuerpos disponibles, que pueden ser etiquetadas como marcadores específicos en áreas de otra manera inaccesibles del cuerpo, proporciona penetraciones sin precedentes en los procesos moleculares y celulares en modelos de tumorigenesis y neurodegenerativas, enfermedades cardiovasculares, inmunológicas e inflamatorias7.
En este estudio, describimos el uso de la tomografía de fluorescencia-mediada en un modelo murino de la colitis. Dextrán sulfato de sodio (DSS)-colitis inducida es un modelo estándar del ratón inducida químicamente de la inflamación intestinal que se asemeja a inflamatoria intestinal (EII) de la enfermedad10. Es particularmente útil evaluar la contribución del sistema inmune innato para el desarrollo de la inflamación de intestino11. Puesto que el reclutamiento, activación y la infiltración de monocitos y macrófagos representan pasos cruciales en la patogenia de la EII, visualización de su contratación y la cinética de la infiltración son esenciales para monitorear, por ejemplo, el efecto de sustancias terapéuticas potenciales en un entorno preclínicos12. Describimos la inducción de colitis DSS y demostrar la caracterización de tomografía-mediada de la infiltración de macrófagos en la mucosa intestinal con fluorescencia molecular tomografía para la visualización específica del marcador de monocito/macrófago F4/80 13. Además, ilustramos procedimientos auxiliares y suplementarios, como anticuerpo etiquetado; la disposición experimental; y análisis e interpretación de las imágenes obtenidas, en correlación con lecturas convencionales tales como índices de actividad de la enfermedad, fluyen cytometry y análisis histológico e inmunohistoquímica. Se discuten las limitaciones de esta técnica y las comparaciones con otras modalidades de imágenes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque las técnicas médicas de imagen han evolucionado rápidamente en los últimos años, todavía estamos limitados en nuestra capacidad para detectar procesos inflamatorios o tumores, así como otras enfermedades, en sus primeras etapas de desarrollo. Sin embargo, esto es crucial para el crecimiento del tumor comprensión, invasión, metástasis desarrollo y procesos celulares en el desarrollo de trastornos inflamatorios y enfermedades degenerativas, cardiovasculares e inmunológicas. Mientras que las técnicas de i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Sra. Sonja Dufentester, Sra. Elke Weber y Sra. Klaudia Niepagenkämper por la excelente asistencia técnica.
Materials
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
| Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
| Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
| Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
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