На месте Характеристика Shewanella oneidensis MR1 биоплёнки Сальви и ToF-SIMS

Summary

Эта статья представляет метод для выращивания биопленки в situ время полета вторичной ионной масс-спектрометрии для химического сопоставления в своем гидратированных состоянии, активизируемые microfluidic реактора, системы для анализа на интерфейсе жидкий вакуум. Shewanella oneidensis -MR-1 с зеленым флуоресцирование белками использовался в качестве модели.

Abstract

Бактериальные биопленки, поверхность ассоциированных сообществ, которые значительно учился понимать их собственного производства внеклеточного полимерных веществ (EPS) и их роли в микробиологии окружающей среды. Это исследование описывает метод культивировать биопленки привязанность к системе для анализа в жидкий вакуум интерфейс (Сальви) и достичь в situ химического сопоставления жизни биопленки, время полета вторичной ионной масс-спектрометрии (ToF-SIMS). Это делается путем культивирования бактерий как снаружи, так и внутри Сальви канал с нашей специализированной установки, а также оптические методы обработки изображений для обнаружения присутствия биопленки и толщина до анализа ToF-SIMS. Наши результаты показывают характеристика вершины Shewanella биопленки в своем естественном состоянии гидратированных, подчеркнув его локализованные водных кластеров окружающей среды, а также EPS фрагменты, которые резко отличаются от же биопленки обезвоженные состояние. Эти результаты демонстрируют возможности прорыва Сальви, что позволяет в situ биопленки изображений с вакуум основе химических изображений инструмент.

Introduction

Бактериальные биопленки, поверхность ассоциированных сообществ, которые развивались с течением времени как обороны для бактерий, чтобы выжить, различных неблагоприятных физических и механических раздражителей, которой клетки способны вложить и выжить во многих возможных средах. ^{1 , 2} биоплёнки значительно исследованы и имеют применение во многих областях, таких как биомедицина, биомедицинской инженерии, сельское хозяйство и промышленных исследований и разработок. ^{1 , 2} понимание химического сопоставления этих сложных микробных общин, включая их собственного производства внеклеточного полимерных веществ (EPS) и их местные воды в кластерной среде, имеет важное значение для получения точной и подробной Описание их деятельности в биологической области. ²

Биоплёнки существовать и развиваться в рамках сильно увлажненной государства. Это представляет большой проблемой при использовании вакуум-на основе анализа поверхности методы, такие как время полета вторичной ионной масс-спектрометрии (ToF-SIMS) из-за трудности в изучении летучих жидкостей в вакууме. В результате вакуум-на основе анализа поверхности методы были ограничены почти исключительно для изучения биопленки образцы только их сушеные штата. Однако изучая биопленки в состоянии сушеные препятствует точной расследование его истинное биологических микроокружения. Это часто вызывает радикальные изменения в EPS целостности и биопленки морфологии, которая была продемонстрирована после сравнения сухой биопленки массы спектральных результаты в situ жидкого исследования. ^{3 , 4} эта статья представляет собой решение для изучения биопленки в их естественном состоянии, увлажненной, используя использования нашей системы для анализа в жидкий вакуум интерфейс (Сальви),^5,6 microfluidic реактора, содержит жидкость под ее тонкий кремния нитрид (SiN) мембраны в микроканальные из полидиметилсилоксан (PMDS), таким образом обеспечивая прямой доступ к Луч зонд вторичных ионов при сохранении структурной целостности жидкие матрицы в вакууме камеры. ^{7 , 8}

S. oneidensis мутировал выразить зеленый флуоресценции белков (ГПУП) MR-1 был выбран в качестве модельного организма для этой процедуры иллюстрации биопленки благодаря метаболических универсальность и общего пользования в экологических и прикладной микробиологии, который был основан сильно на ее уникальной способностью для металлических сокращения и передачи внеклеточных электрона. ^{9 , 10 , 11} Кроме того, присутствие GFP позволило легко непрерывной биопленки толщина мониторинга через микроскопии флуоресцирования, используя фильтр флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC). Наши предыдущие исследования показали доказательства этой бактерии пользу привязанность к окну грех, с использованием в operando визуализации флуоресценции для роста биопленки толщиной до 100 мкм. ^{4 , 12} в то время как этот документ будет обсуждать только подтверждение биопленки в присутствия посредством микроскопии флуоресцирования, Сальви совместим с другими оптических изображений методы, такие как супер резолюции флуоресценции изображений (т.е., структурированного освещения микроскопия (SIM)⁹) и Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) изображений⁴). Оптических изображений может служить для измерения толщины биопленки и получить изображение 3D, форма биопленки, как представляется, подтверждает его толщины и его привязанность к окну грех. ⁹ хотя GFP был использован в анализе SIMS, S. oneidensis без GFP использовался для роста кривой, как только необходимые измерения оптической плотности и не требует каких-либо флуоресцентных изображений. Как правило разница между GFP с тегами и непомеченным видов в кривая роста является незначительным. Кроме того в то время как этот протокол использует S. oneidensis GFP MR-1 в качестве модельного организма для описания процедуры, эта процедура предназначена для любых бактериальный штамм, который могут быть необходимы для выращивания в пределах SALVI. Хотя, учитывая знания бактериальный штамм необходимо, некоторые условия роста, например, времени, температуры и кислорода среды может потребоваться быть изменены для размещения штамм бактерий, которые будут использоваться. Для среднего роста эта процедура использует «нанопроволоки» средний, tryptic соевый бульон (TSB) без декстрозы и tryptic соевый агар (TSA) без декстроза для культивирования. Состав «нанопроволоки» средний специально разработан для роста и для мониторинга расширения мембраны и periplasm S. oneidensis , появляются принимать форму небольших проводов, и средний состав был создана в рамках предыдущих исследований. ^{13 , 14}

Наш предыдущий протокол в situ жидкого ToF-SIMS продемонстрировал преимущество что Сальви предлагает для иммобилизации белков и привязанность к грех, а также подробный протокол на ToF-SIMS анализа и данных сокращения. ¹² вместо того, чтобы подтвердить данные этапов сокращения, этот документ будет служить вместо этого сосредоточить внимание на уникальный подход, создание и выращивание биопленки в рамках нашей микроканальные Сальви, а также изображений шаги для обнаружения присутствия биопленки и толщина предварительного для анализа ToF-SIMS. В то время как биопленки ранее были ограничены только высушено образцов в рамках палаты поверхности аналитические методы, основанные на вакуум, детальное EPS и биопленки химическое картирование живой биоплёнки теперь могут быть получены, на месте из-за этой новой возможности.

Protocol

1. Подготовка материалов Подготовка среднего трубки бутылки сыворотки (один в биопленки культуры и три необходимых за кривой роста необходимо) Примечание: как упоминалось во введении, любой рост среда подходит для обеспечивают питательные вещества, необходимые д…

Representative Results

Эти представительные результаты служат Показать как химического профиля прилагаемый биопленки могут быть определены и интерпретируется, как полученные через ToF-SIMS. После построения массовых спектров от сбора данных ToF-SIMS, кратко говорится в разделе процедуры, пик иде…

Discussion

После прививки в лаг фазы, важно проверить количество дней и температуры, при котором биопленки должен расти, прежде чем это здоровым и достаточно толстым для изображений, как описано в пункте 3.1. Эта процедура конкретно охватывает выращивание S. oneidensis MR1 биопленки при комнатной температ…

Materials

ToF-SIMS	IONTOF	TOF.SIMS 5	Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)	Pacific Northwest National Laboratory	N/A	SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer	New Brunswick Scientific	N/A	U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator	BioCold Scientific	N/A	COLDBOX1
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	N/A	Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump	Cole-Parmer	EW-74905-02	Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator	Barnstead International	LT1465X3	Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave	Getinge	533LS	Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	4001-000	GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet	Thermo Fisher Scientific	1385	1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope	Nikon	N/A	Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter	Mettler Toledo	51302803	Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union	Valco	ZU1TPK	For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage	IONTOF	N/A	Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System	Thermo Fisher Scientific	D11921	ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette	Thermo Fisher Scientific	21-377-821	Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip	Neptune	2112.96.BS	1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle	Stanley	N/A	Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe	BD	309659	1 mL
Syringe	BD	309657	3 mL
Syringe	BD	309646	5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe	BD	309604	10 mL
Syringe	BD	302830	20 mL
Disposable Pipette	Thermo Fisher Scientific	13-678-11	25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler	Pipet-aid	P-57260	Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle	Sigma	33109-U	Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube	VWR	89167-178	Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper	Sigma	27235-U	Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum)	Sigma	27227-U	Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper	Wheaton	224307	30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing	Supelco	58697-U	1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes	GMBH	759085D	1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle	BD	303015	22G; used for serum bottle injection.
Needle	BD	305120	23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP	N/A	N/A	Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94.
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	S25310A	95% Denatured
TSA	BD	212305	Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer	Sigma	P-1851	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide	Sigma	S-5881	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride	Sigma	A-5666	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride	Sigma	P-4504	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S-9638	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride	Thermo Fisher Scientific	S271-3	Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate	Sigma	L-1375	60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate	Sigma	S-5761	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt	Sigma	N-0253	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride	Sigma	451649	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate	Sigma	208094	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate	Sigma	M-7634	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate	Sigma	215422	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma	223506	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride	Sigma	60818	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride	Sigma	229997	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate	Sigma	C-8027	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate	Sigma	237086	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid	Sigma	B-6768	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate	Sigma	331058	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride	Sigma	339350	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate	Sigma	14304	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin	Sigma	47868	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid	Sigma	F-7876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride	Sigma	P-9755	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2)	Sigma	47861	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride	Sigma	T-4625	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid	Sigma	N4126	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt	Sigma	21210	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12	Sigma	V-2876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid	Sigma	A-9878	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid	Sigma	T-1395	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}