Reinigung der Membran-Fach für endoplasmatische Retikulum-assoziierten Abbau von exogenen Antigenen in Kreuz-Präsentation
Summary
Die hier beschriebene Methode ist eine neue Vesikel Isolierung Protokoll, das für die Reinigung von den zellulären Kompartimenten ermöglicht dem exogene Antigenen durch endoplasmatische Retikulum verbundenen Abbau in Kreuz-Präsentation verarbeitet werden.
Abstract
Dendritische Zellen (DCs) sind leistungsfähige Verarbeitung und verinnerlichten exogene Antigene auf großen Histocompatibility-Klasse (MHC) zu präsentieren ich Moleküle auch bekannt als Kreuz-Präsentation (CP). CP spielt eine wichtige Rolle nicht nur in der Stimulation der naiven CD8+ T Zellen und Gedächtnis CD8+ T-Zellen für infektiöse und Tumor Immunität sondern auch bei der Inaktivierung von selbsttätige naive T-Zellen durch T-Zell-Anergie oder T-Zell-Löschung. Wenn auch der kritischen molekularen Mechanismus der CP geklärt werden noch, gibt es sammeln Hinweise darauf, dass exogene Antigene durch endoplasmatische Retikulum verbundenen Abbau (ERAD) nach dem Export aus nichtklassischen endocytic verarbeitet werden Fächer. Bis vor kurzem waren Charakterisierungen dieser endocytic Abteilungen beschränkt, denn es keine spezifische molekulare Marker als exogene Antigene gab. Die hier beschriebene Methode ist ein neues Protokoll Vesikel Isolierung, die für die Reinigung dieser endocytic Abteilungen ermöglicht. Mit diesem gereinigten Microsome, rekonstituiert wir ERAD-wie Transport, Ubiquitination und Verarbeitung des exogene Antigen in Vitro, was darauf hindeutet, dass das Ubiquitin-Proteasom-System die exogene Antigen nach dem Export aus dieser verarbeitet Handy-Fach. Dieses Protokoll kann weiter auf andere Zelltypen zu klären, den molekularen Mechanismus der CP angewendet werden.
Introduction
Die MHC ich Moleküle auf der Oberfläche aller kernhaltigen Zellen, mit kurzen Antigene Peptide abgeleitet endogene Antigene, die durch das Ubiquitin-Proteasom-System in der Zellflüssigkeit1verarbeitet werden ausgedrückt werden. Nach der Bearbeitung werden Antigene Peptide in das endoplasmatische Retikulum (ER)-Lumen von Peptid-Transporter TAP transportiert. Das ER-Lumen eine Reihe von spezifischen Chaperone unterstützen das Peptid-laden und die korrekte Faltung des MHC ich komplexe. Diese Reihe von Molekülen nennt man die Peptid-laden-Komplex (PLC), darauf hinweist, dass ER ein zentrales Fach für Peptid laden auf MHC ich2. Nach Peptid laden, MHC ich Moleküle an der Zelloberfläche transportiert und spielen eine Schlüsselrolle bei der adaptiven Immunsystems als selbständige Marker und ermöglicht die CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs), Krebszellen oder Krankheitserreger erkennen von Antigenen Peptide aus Nichtselbst Proteine3.
Antigenpräsentierende Zellen (APC), Antigene Peptide aus exogene Antigene sind auch auf MHC habe ich4,5,6,7,8 über CP, das hauptsächlich getragen wird vorgestellt von DCs9,10,11. CP ist wichtig sowohl für die Aktivierung von naiven CD8+ T Zellen und Gedächtnis CD8+ T-Zellen gegen Infektionen und Anti-Tumor CTLs12,13, und bei der Aufrechterhaltung der Immuntoleranz durch die Inaktivierung der selbsttätige naive T-Zellen14,15. Der CP spielt viele wichtige Rollen in das adaptive Immunsystem jedoch die molekularen Mechanismen der CP müssen noch im Detail beschrieben werden. Frühere Studien der CP ergab, dass exogene Antigene, in der ER und das Endosom lokalisiert wurden und wurden von ERAD, was darauf hindeutet, dass exogene Antigene, die ER für ERAD-wie Verarbeitung und laden16 Peptid aus dem Endosom transportiert werden verarbeitet . Sammeln Beweise deutet jedoch darauf hin, dass das Peptid-Laden von CP durchgeführt wird, nicht in der Notaufnahme sondern im nicht-klassischen endocytic Fächer, die auch Besonderheiten der ER (Abbildung 1)17,18 ,19,20,21. Zur Vermeidung von Abbau der Antigen Peptid Vorläufer von der hohen Aktivität des Aminopeptidase tritt22 im Zytosol, Verarbeitung und Peptid im CP laden im proximalen Bereich dieser nichtklassischen endocytic Abteilungen (Abbildung 1). Obwohl die Charakterisierungen dieser endocytic Abteilungen umstritten sind, gibt es keine bestehende spezifische Moleküle als exogene Antigene in diesem Fach.
ERAD ist ein zellulärer Weg, der speziell fehlgefaltete Proteine aus dem ER entfernt. In dem ERAD Weg fehlgefaltete Proteine Doppelthebel durch die ER-Membran, das Zytoplasma transportiert und verarbeitet von den Ubiquitin-Proteasom System23,24,25. Beim Transport von großer Molekülen wie Proteinen, durch die Lipid-Bilayer durchlaufen diese Moleküle ein molekularer Apparat namens ein Translocon, wie der Sec61 komplex und Delrin Komplex in die ER26, und die komplexe Tom und Tim Komplex in der Mitochondrien-27. Wenn exogen hinzugefügt Antigene durch die ER-Membran transportiert werden, müssen sie die Lipid-Bilayer im Komplex mit Translocons, wie den Sec61-Komplex eindringen. Die hier beschriebene Methode gereinigt die gezielte Blase durch die Nutzung dieser Membran durchdringen Moleküle als Marker für die endocytic Fächer.
Die hier beschriebene Methode ist ein neues Vesikel-Reinigung-Protokoll mit der DC-ähnliche Zelle Zeile DC2.428 und biotinylierte Ovalbumin (bOVA) als eine exogene Antigen. Die endocytic Fächer wurden gereinigt, indem Streptavidin (SA)-magnetische Beads, die mit der Membran durchdringen bOVA als Hersteller. In diesem gereinigten Microsome hinzugefügt einige exogen bOVA blieb noch in Bruchteilen Membran aber waren an der Außenseite des Microsome und dann Ubiquitinated transportiert und verarbeitet in-vitro-29. Dieses gereinigte Microsome enthielt nicht nur endocytic Fach-spezifische Proteine, sondern auch ER ansässigen Proteine für ERAD und das Peptid Komplex laden; darauf hindeutet, dass das zelluläre Fach das prospektive endocytic Fach für CP29. Dieses Protokoll ist nicht abhängig von der Art der exogene Antigene und gilt auch für andere DC-Subsets und andere Zelltypen, z. B. Endothelzellen, Makrophagen und B-Zellen, den genaue molekularen Mechanismus der DCs für kompetente CP zu klären.
Protocol
Representative Results
Discussion
In früheren Studien von CP eingearbeitete exogene Antigene in den geschützten Bereich des späten Endosom oder ER durch immunofluorescent Mikroskopie16,30,31,32angesammelt. Es wird geschätzt, dass ERAD-wie Transport und Verarbeitung von exogenen Antigenen in diesen spezialisierten Bereichen ER oder späten Endosom durchgeführt werden, wie das zelluläre Fach von Saccharose oder Iodixanol Di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird von der Takasaki Hochschule für Gesundheit und Soziales unterstützt.
Materials
| RPMI 1640 | gibco by life technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Equitech bio | SFB30 | |
| Sodium pyruvate | gibco by life technologies | 11360-070 | |
| MEM non-essential amino acids | gibco by life technologies | 11140-050 | |
| HEPES | gibco by life technologies | 15630-080 | |
| 2-mercaptoethanol | gibco by life technologies | 21985-023 | |
| L-glutamine | gibco by life technologies | 25030-164 | |
| Penisicillin-Sreptomycin | gibco by life technologies | 15140-122 | |
| DMEM | gibco by life technologies | 12100-46 | |
| OVA | SIGMA | A5503 | |
| Biotin-protein labelling kit | Thermo Fisher Scientific | F6347 | |
| MG-132 | Santa Cruz Biotechnology | 201270 | |
| lactacystin | SIGMA | L6785 | |
| Dounce homogenizer | IUCHI | 131703 | |
| protease inhibitor cocktails | SIGMA | P8340 | |
| iodixanol | Cosmo bio | 1114542 | |
| SA-magnetic beads | New England Biolabs | 201270 | |
| control magnetic beads | Chemagen | M-PVA012 | |
| magnetic stand | BD Biosciences | 552311 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| silver staining kits | Cosmo bio | 423413 | |
| Reticulocyte Lysate | Promega | 1730714 | |
| Flag-tagged ubiquitin | SIGMA | U5382 | |
| anti-ovalbumin (OVA,mouse) | Antibody Shop | HYB 094-06 | |
| ant-multi-ubiquitin (mouse) | MBL | D058−3 | |
| anti-Flag (mouse) | SIGMA | F3165 | |
| trypsin | SIGMA | 85450C |
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