Bestemmelse av eksponering av celloverflate og endocytisk proteinprotein i primære astrocytkulturer ved bruk av biotinylering
Summary
To biotinyleringsbaserte metoder, utformet for å bestemme celleoverflateekspresjonen og endocytisk hastighet av proteiner uttrykt ved plasmamembranen, presenteres i denne rapporten.
Abstract
Cell-overflateproteiner formidler et bredt spekter av funksjoner. I mange tilfeller er deres aktivitet regulert av endocytiske prosesser som modulerer nivåene deres ved plasmamembranen. Her presenterer vi detaljerte protokoller for 2 metoder som letter undersøkelsen av slike prosesser, som begge er basert på biotinylering av celleoverflateproteiner. Den første er utformet for å tillate den semikvantitative bestemmelse av de relative nivåene av et bestemt protein ved celleoverflaten. I det er lysinrester av plasmamembranproteiner av celler først merket med en biotinnedel. Når cellene lyseres, kan disse proteinene deretter spesifikt utfelles via bruk av agarose-immobilisert streptavidin ved å utnytte den naturlige affiniteten til sistnevnte for biotin. Proteinene isolert på en slik måte kan deretter analyseres via en standard western blotting-tilnærming. Den andre fremgangsmåten gir et middel for å bestemme endocytisk hastighet av et partikkelAr celleoverflate mål over en tidsperiode. Cell-overflateproteiner blir først modifisert med et biotinderivat som inneholder en spaltbar disulfidbinding. Cellene blir deretter skiftet tilbake til normale dyrkningsbetingelser, hvilket forårsaker endocytisk opptak av en andel biotinylerte proteiner. Deretter reduseres disulfidbindingene til ikke-internaliserte biotingrupper ved bruk av det membran-impermeable reduksjonsmiddelet glutation. Via denne tilnærmingen kan endocytoserte proteiner således isoleres og kvantifiseres med en høy grad av spesifisitet.
Introduction
Proteiner på celleoverflaten spiller en rekke roller sentralt for å opprettholde cellefunksjonen. I mange tilfeller er deres aktivitet avhengig av eller modulert av endocytiske prosesser som enten midlertidig sekvestrerer dem i intracellulære områder, eller som leder dem mot nedbrytningsveier 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Her fremhever vi 2 biotinyleringsbaserte tilnærminger designet for å tillate brukeren å spesifikt merke og isolere proteiner uttrykt ved plasmamembranen, og de nylig internaliserte. Via disse metodene kan celleoverflateekspresjonen og endocytisk hastighet for et hvilket som helst protein av interesse kvantifiseres, slik at en klarere vurdering av dens regulering kan oppnås.
Bestemmelse av relativ celleoverflateproteinuttrykk ved biotinylering
Biotin, eller vitamin B7, tidligere kjent som vitamin H6, er et lite vannløselig molekyl som kan brukes til å kjemisk modifisere reaktive amin, sulfhydryl og karboksylgrupper av biologiske molekyler. Den nåværende avlingen av biotinyleringsreagenser av celleoverflate består hovedsakelig av membran-impermeant sulfonerte N-hydroksysuccinimid (sulfo-NHS) estere av biotin eller dets derivater, designet for å reagere med aminer tilstede på sidekjeder av lysinrester av proteiner uttrykt ved Celleoverflaten når disse blir deprotonert under basiske betingelser, hvilket resulterer i at sistnevnte danner en amidbinding med biotindelen 7 . Således modifiserte, celleoverflateproteiner kan deretter isoleres ved bruk av avidin, et 66-69 kDa tetramert protein som har stor affinitet for biotin, bindende til sistnevnte med en dissosiasjonskonstant på ca. 10-15 , som markerer den som en av de Sterkeste ikke-kovalente interaksjoner kjent 8 </suP> , 9 .
Et antall alternative metoder for kvantifisering av proteinuttrykk på celleoverflaten har blitt brukt i tidligere studier. Merking av upermeabiliserte celler ved bruk av fluorescens-merkede antistoffer som er spesifikke for protein av interesse, etterfulgt av visualisering via fluorescensmikroskopi, er for eksempel en vanlig benyttet tilnærming, men er sterkt avhengig av tilgjengeligheten av antistoffer som kan binde til ekstracellulære epitoper. Mer nylig har metoder som involverer bruk av kimære proteiner som bærer pH-følsomme fluoroforer som reagerer på å bli utsatt for sure medier, også blitt anvendt med suksess 10 . Imidlertid involverer slike analyser vanligvis den eksogene ekspresjon av disse konstruksjonene i cellelinjer hvor proteinet av interesse ikke er funnet naturlig. Disse tilnærmingene er likevel i stand til å gi verdifull informasjon om subcellulær lokalisering og eksocytisk reiserute avMålprotein, og bør derfor brukes sammen med biotinyleringsbaserte tilnærminger som beskrives her hvis verktøyene er tilgjengelige.
I en typisk biotinyleringsanalyse vaskes cellene først grundig i 4 ° C PBS. Dette fjerner spor av serumproteiner introdusert av dyrkingsmediet, og sikrer dermed at disse ikke vil forbruke overflødige mengder biotin i neste trinn. Enda viktigere, reduksjonen i temperaturen forårsaker endocytose å senke betydelig. Biotinyleringsreagenset blir så tilsatt. Deretter vaskes cellene igjen og inkuberes deretter med en slokkingsbuffer som inneholder enten glycin eller NH4Cl, hvis formål er å inaktivere alle resterende spor av uomsatt biotin. Cellene lyseres deretter, hvoretter agarose-immobilisert streptavidin blir tilsatt for å utfelle de biotinylerte proteiner. Analyse utføres vanligvis via western blotting, slik at den relative celleoverflateekspresjon av forskjellige prOteins å bli kvantifisert.
På grunnlag av grunnlaget for denne analysen er den egnet for bruk bare med proteiner som har deler som er utsatt for det ekstracellulære miljø. Multipass transmembrane proteiner, som sannsynligvis har en rekke reaktive lysiner innenfor deres sløyfeområder, er mest mottagelige for denne metoden, mens enkeltpasproteiner har en tendens til å være mindre utsatt for biotinylering. Selv i disse tilfellene er det fortsatt en mulighet for at konformasjonsendringer eller intermolekylære interaksjoner kan utelukke visse reaktive steder, noe som resulterer i et lavere enn forventet biotinyleringsutbytte.
Bestemme internaliseringshastigheten av celleoverflateproteiner ved biotinylering
Prinsippene for denne analysen er i stor grad likt den av celleoverflatebiotinylering, med en rekke unntak, hvorav det viktigste er bruk av reversible biotinyleringsreagenser. Biotingruppene (av disse) har disuLfide bindinger, innenfor deres strukturer, som er mottakelige for reduksjonsmidler; Dette utnyttes for å sikre at bare celleoverflateproteiner tatt inn i intracellulære steder i assayperioden vil bli biotinylert. En analyse utføres generelt på følgende måte. Cellene vaskes først og biotinyleres med kaldreagenser, deretter gjenvinnes celledyrkningsmedium ved 37 ° C, og cellene returneres til inkubatoren. Dette fører til at de merkede celleoverflateproteinene gjennomgår endocytose. Reduksjonsmiddelet glutation – som ikke kan trenge inn i membranen – blir så tilsatt for å bryte disulfidbindingene av biotinnene festet til proteiner som er igjen på celleoverflaten. Til slutt omsattes de brutte disulfidbindingene med jodacetamid, forbruker de labile tiolgruppene og forhindrer bindingene fra å reformere. Som tidligere lyseres cellene deretter, og de merkede proteiner utfelles under anvendelse av streptavidin-agarose.
Begrensningene diskenBrukes i den forrige delen gjelder også her på grunn av likhetene som deles mellom metodene. I tillegg er det verdt å huske på at temperaturforskyvene som er involvert i denne analysen, utelukker den nøyaktige bestemmelse av hvor mye protein som er endocytosed for hvert tidsforløp, spesielt når det gjelder raskt internaliserte eller raskt resirkulerende proteiner. Analysen gir derfor bare en semiquantitative estimering av endocytiske hastigheter. Total internrefleksjon fluorescensmikroskopi kan brukes til å spore opptaket av hver lastet vesikkel og gi en mer presis måling av kinetikken til endocytose. Det kan derfor gi et meget nyttig komplement til denne analysen, forutsatt at en fluorescensmerket merket kimær konstruksjon av proteinet av interesse er tilgjengelig 11 .
Protocol
Representative Results
Discussion
modifikasjoner:
Da disse metodene ble konstruert for bruk med adherente celler, har vi spesifisert bruk av PBS som inneholder 100 mg / L MgCl2 · 6H20 og
100 mg / l CaCl2 (CM-PBS) for vaskingstrinnene og som base av visse buffere for å sikre at cellene forblir festet til kulturoverflaten og at cellekryssene ikke forstyrres. Protokollene kan imidlertid også brukes på ikke-adherente celletyper dersom cellene pelleteres i mellom hvert trinn i prosedyren. I disse tilfe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette prosjektet ble støttet av Canadian Institute of Health Research PG # 20R47867.
Materials
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | #1610404 | |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA) | Bio-Rad | #1610729 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610611 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21335 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21331 | |
| Fetal bovine serum | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Iodoacetamide | Bio-Rad | #163-2109 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich | L2020 | Thaw on ice. |
| L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15) | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5) | Leica Biosystems | B-DG-CE | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G6529 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 862010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Streptavidin agarose resin | Thermo Fisher Scientific | #20347 | |
| Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody | Alomone | AQP-004 | |
| Tris base (Trizma base) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
- Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes. J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).
- Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).
- Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase. Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).
- Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).
- Li, Y., Cam, J., Bu, G. Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction. Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).
- Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R. Science. 91 (2358), 243-245 (1940).
- Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates. Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).
- Green, N. M. Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay. Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).
- Korpela, J. Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research. Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J Vis Exp. (69), e4450 (2012).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. (92), e51805 (2014).
- Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes. J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Madrid, R., et al. Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes. EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).
- Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes. PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).
