تحديد التعبير عن سطح الخلية ومعدل إندوسيتيك من البروتينات في الثقافات أستروسيت الابتدائية باستخدام بيوتينيلاتيون
Summary
تم عرض اثنين من الطرق القائمة على بيوتينيلاتيون، والمصممة لتحديد التعبير سطح الخلية ومعدل إندوسيتيك من البروتينات أعرب في غشاء البلازما، في هذا التقرير.
Abstract
بروتينات سطح الخلية توسط مجموعة واسعة من الوظائف. في كثير من الحالات، وينظم نشاطها من قبل عمليات إندوسيتيك التي تعدل مستوياتها في غشاء البلازما. هنا، نقدم بروتوكولات مفصلة لطريقتين التي تسهل دراسة مثل هذه العمليات، وكلاهما تقوم على مبدأ بيوتينيلاتيون من البروتينات سطح الخلية. تم تصميم الأول للسماح لتحديد شبه الكمي من المستويات النسبية للبروتين معين على سطح الخلية. في ذلك، يتم وصف بقايا ليسين من البروتينات غشاء البلازما من الخلايا لأول مرة مع شراب البيوتين. مرة واحدة يتم ليسد الخلايا، ويمكن بعد ذلك عجلت هذه البروتينات على وجه التحديد عن طريق استخدام الاغاروز يجمد ستريبتافيدين من خلال استغلال تقارب الطبيعي من هذا الأخير لالبيوتين. ويمكن بعد ذلك تحليل البروتينات المعزولة في مثل هذه الطريقة عن طريق نهج الغربية النشاف القياسية. الطريقة الثانية توفر وسيلة لتحديد معدل إندوسيتيك من الجسيماتأر على سطح الخلية على مدى فترة من الزمن. يتم تعديل البروتينات سطح الخلية لأول مرة مع مشتق البيوتين تحتوي على السندات ثاني كبريتيد قابل للانقسام. ثم تحولت الخلايا مرة أخرى إلى ظروف الثقافة العادية، والذي يسبب امتصاص الإتقان من نسبة من البروتينات البيروكسيديز. بعد ذلك، يتم تقليل السندات ثاني كبريتيد مجموعات البيوتين غير استيعابها باستخدام غلوتاثيون عامل غشاء كتيمة الحد. من خلال هذا النهج، وبالتالي يمكن أن تكون معزولة البروتينات إندوسيتوسد وكمية مع درجة عالية من الخصوصية.
Introduction
البروتينات على سطح الخلية تلعب مجموعة متنوعة من الأدوار المركزية للحفاظ على وظيفة الخلية. في العديد من الحالات، يعتمد نشاطهم على، أو التشكيل من قبل عمليات التطعيم التي إما احتجازها مؤقتا في المواقع داخل الخلايا، أو أن توجهها نحو مسارات التحلل 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 . هنا، ونحن نسلط الضوء على 2 النهج القائم على بيوتينيلاتيون تهدف إلى السماح للمستخدم على وجه التحديد علامة وعزل البروتينات أعرب في غشاء البلازما، وتلك التي استوعبت حديثا. وباستخدام هذه الطرق، يمكن تقدير حجم التعبير عن سطح الخلية ومعدل الإلتهاب من أي بروتين من الفائدة، مما يسمح بإجراء تقييم أوضح لتنظيمها.
تحديد النسبي البروتين سطح الخلية التعبير عن طريق بيوتينيلاتيون
البيوتين، أو فيتامين B7، المعروف سابقا باسم فيتامين H 6 ، هو جزيء صغير قابل للذوبان في الماء يمكن استخدامه لتعديل كيميائي أمين تفاعلي، سلفهيدريل، وكربوكسيل مجموعات من الجزيئات البيولوجية. يتكون المحصول الحالي من الكواشف بيوتينيلاتيون سطح الخلية في المقام الأول من استرات سولفوناتد N- هيدروكسيسوتشينيميد (سولفو-نهس) غشاء من البيوتين أو مشتقاته في المقام الأول، مصممة للرد مع الأمينات الموجودة على سلاسل جانبية من بقايا الليزين من البروتينات أعرب في سطح الخلية عندما تصبح هذه ديبروتوناتد في ظل الظروف الأساسية، مما أدى إلى الأخير تشكيل رابطة أميد مع شراب البيوتين 7 . وهكذا يمكن عزل البروتينات سطح الخلية بعد ذلك عن طريق استخدام أفيدين، وهو 66-69 كيلو دالتون تيترامريك البروتين التي تمتلك تقارب كبير للبيوتين، ملزمة لهذا الأخير مع ثابت التفكك ما يقرب من 10 -15 ، بمناسبة أنها واحدة من أقوى التفاعلات غير التكافلية المعروفة 8 </sup> ، 9 .
وقد تم استخدام عدد من الطرق البديلة لقياس التعبير البروتين على سطح الخلية في الدراسات السابقة. وضع العلامات من الخلايا أونرمبيليزد باستخدام الأجسام المضادة الموسومة فلورزنتلي محددة للبروتين من الفائدة، تليها التصور عن طريق المجهر مضان، على سبيل المثال، هو نهج شائع الاستخدام، ولكن يعتمد بشكل كبير على توافر الأجسام المضادة التي يمكن أن ترتبط إلى الحواتم خارج الخلية. وفي الآونة الأخيرة، استخدمت أيضا أساليب تنطوي على استخدام البروتينات خيالية تحمل فلوروفوريس الحساسة الرقم الهيدروجيني التي تتفاعل مع التعرض لوسائل الإعلام الحمضية بنجاح 10 . ومع ذلك، مثل هذه المقايسات وعادة ما تنطوي على التعبير الخارجي لهذه البنيات في خطوط الخلايا التي لم يتم العثور على البروتين من الفائدة أصلا. هذه النهج هي مع ذلك قادرة على توفير معلومات قيمة بشأن توطين تحت الخلوية وخط سير إكسوسيتيك منالبروتين المستهدف، وبالتالي يجب أن تستخدم جنبا إلى جنب مع النهج القائم على بيوتينيلاتيون الموصوفة هنا إذا كانت الأدوات المتاحة.
في مقايسة بيوتينيلاتيون نموذجي، يتم غسلها لأول مرة الخلايا تماما في 4 درجات مئوية بس. هذا يزيل أي آثار من البروتينات المصل التي أدخلتها وسائل الإعلام، وبالتالي ضمان أن هذه لن تستهلك كميات زائدة من البيوتين في الخطوة التالية. الأهم من ذلك، انخفاض درجة الحرارة يسبب الإلتقام إلى التباطؤ بشكل ملحوظ. ثم يتم إضافة كاشف بيوتينيلاتيون. بعد ذلك، يتم غسل الخلايا مرة أخرى، ومن ثم حضنت مع المخزن المؤقت التبريد التي تحتوي على إما الجلايسين أو نه 4 كل، والغرض منها هو تعطيل جميع الآثار المتبقية من البيوتين غير المتفاعل. ثم يتم ليسد الخلايا، وبعد ذلك يضاف أغاروس ستريبتافيدين يجمد لترسيب البروتينات البيروكسيديز. ويتم التحليل عادة عن طريق النشاف الغربية، مما يسمح للتعبير النسبي سطح الخلية من مختلف العلاقات العامةأوتينز أن يكون كميا.
ويرجع ذلك إلى أساس هذا الفحص، وهي مناسبة للاستخدام فقط مع البروتينات التي تمتلك أجزاء تتعرض للبيئة خارج الخلية. تعدد البروتينات الغشائية، التي تمتلك على الأرجح عددا من ليسينس رد الفعل داخل المناطق حلقة، هي الأكثر قابلية لهذا الأسلوب، في حين أن البروتينات تمرير واحد تميل إلى أن تكون أقل عرضة لكونها بيوتينيلاتد. حتى في هذه الحالات، لا يزال هناك احتمال أن التغيرات التوافقية أو التفاعلات بين الجزيئات قد تلغي بعض المواقع رد الفعل، مما أدى إلى العائد بيوتينيلاتيون أقل من المتوقع.
تحديد معدل الاستيعاب للبروتينات سطح الخلية بواسطة بيوتينيلاتيون
مبادئ هذه المقايسة مشابهة إلى حد كبير لتلك التي بيوتينيلاتيون سطح الخلية، مع عدد من الاستثناءات، وأهمها هو استخدام الكواشف بيوتينيلاتيون عكسها. مجموعات البيوتين (من هذه) تمتلك ديسوفي إطار هياكلها، التي تكون عرضة لعوامل الاختزال؛ يتم استغلال هذا لضمان أن البروتينات فقط سطح الخلية التي اتخذت في المواقع داخل الخلايا خلال فترة الفحص سيتم ترك البيروكسيديز. عادة ما يتم إجراء الفحص على النحو التالي. يتم غسلها لأول مرة الخلايا والبيروكسيديز مع الكواشف الباردة، ثم يتم إعادة إدخال وسط ثقافة الخلية عند 37 درجة مئوية، ويتم إرجاع الخلايا إلى الحاضنة. وهذا يسبب البروتينات السطحية الخلية المسمى لخضوع الإلتقام. ثم يضاف عامل الجلوتاثيون المختزل – الذي لا يمكن أن يخترق الغشاء – لكسر السندات ثنائية الكبريتيد من شقوق البيوتين المرتبطة بالبروتينات المتبقية على سطح الخلية. وأخيرا، يتم تفاعل السندات ثاني كبريتيد كسر مع يودواسيتاميد، تستهلك مجموعات ثيول عاملة ومنع الروابط من الإصلاح. كما كان من قبل، ثم يتم ليسد الخلايا، وترسب البروتينات المسمى باستخدام ستريبتافيدين-أغاروس.
قرص القيودأوسد في القسم السابق ينطبق أيضا هنا بسبب أوجه التشابه المشتركة بين الأساليب. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه من الجدير أن نضع في اعتبارنا أن التحولات درجة الحرارة المشاركة في هذا الفحص يحول دون التحديد الدقيق لكمية البروتين هو إندوسيتوسد لكل زيادة الوقت، لا سيما في حالة البروتينات استيعابها بسرعة أو بسرعة إعادة التدوير. وبالتالي فإن الفحص يوفر فقط تقدير سيميكانتيتاتيف من معدلات الإلتقام. مجموع المجهر انعكاس الانعكاس الداخلي يمكن استخدامها لتتبع امتصاص كل حويصلة محملة وتوفير قياس أكثر دقة من حركية الإلتقام. وبالتالي يمكن أن توفر مكملا مفيدا جدا لهذا الفحص، على افتراض أن بناء فلورزنتلي الموسومة خيالية من البروتين من الفائدة متاح 11 .
Protocol
Representative Results
Discussion
التعديلات:
كما تم تصميم هذه الأساليب للاستخدام مع الخلايا الملتصقة، حددنا استخدام برنامج تلفزيوني يحتوي على 100 ملغ / L مغكل 2 ∙ 6H 2 O و
100 ملغم / لتر كاكل 2 (سم-بس) لخطوات الغسيل وكقاعدة بعض المخازن المؤقت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا المشروع من قبل المعهد الكندي للبحوث الصحية بغ # 20R47867.
Materials
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | #1610404 | |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA) | Bio-Rad | #1610729 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610611 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21335 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21331 | |
| Fetal bovine serum | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Iodoacetamide | Bio-Rad | #163-2109 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich | L2020 | Thaw on ice. |
| L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15) | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5) | Leica Biosystems | B-DG-CE | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G6529 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 862010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Streptavidin agarose resin | Thermo Fisher Scientific | #20347 | |
| Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody | Alomone | AQP-004 | |
| Tris base (Trizma base) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
- Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes. J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).
- Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).
- Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase. Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).
- Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).
- Li, Y., Cam, J., Bu, G. Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction. Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).
- Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R. Science. 91 (2358), 243-245 (1940).
- Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates. Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).
- Green, N. M. Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay. Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).
- Korpela, J. Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research. Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J Vis Exp. (69), e4450 (2012).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. (92), e51805 (2014).
- Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes. J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Madrid, R., et al. Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes. EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).
- Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes. PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).
