JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생체공학

3D Microtissues для инъекций восстановительной терапии и высок объём наркотиков скрининг

Published: October 04, 2017
doi:
10.3791/55982
, , , , ,
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine,Tsinghua University, 2Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, 3School of Life Sciences,Tsinghua University

Summary

Этот протокол описывает изготовления упругих 3D Макропористые microcryogels путем интеграции микротехнологий с технологией cryogelation. После загрузки с клетками, создаются 3D microtissues, который может быть легко вводится в естественных условиях для содействия регенеративной терапии или собраны в массивы в пробирке скрининга наркотиков высокой пропускной способности.

Abstract

Чтобы обновить традиционные 2D клеточной культуры до 3D клеточной культуры, мы интегрировали микротехнологий с технологией cryogelation для производства Макропористые микромасштабной криогелей (microcryogels), который может быть загружен с различных типов клеток сформировать 3D microtissues. Здесь мы представляем протокол изготовить универсальный 3D microtissues и их применения в восстановительной терапии и наркотиков скрининг. Размер и форма управляемый microcryogels могут быть изготовлены на чипе массива, который может быть заготавливаемым от чип как отдельных клеток загруженных перевозчиков для инъекционного регенеративной терапии или далее собран на чип в 3D microtissue массивы для высокой пропускной способности скрининга наркотиков. Из-за высокой упругой характер этих микромасштабной криогелей 3D microtissues проявляют большой injectability для малоинвазивных клеточной терапии, защищая клетки от механической поперечной силы во время инъекции. Это гарантирует выживание расширенной клетки и терапевтический эффект в мышиной модели ишемии конечности. Тем временем Ассамблея 3D microtissue массивов в стандартном формате 384-multi ну облегчает использование общих лабораторных объектов и оборудования, позволяя высок объём наркотиков скрининг на этой платформе культуры универсальный 3D клеток.

Introduction

Традиционные клеточной культуры на плоского двумерного (2D) поверхностей, таких как культуры блюдо или несколькими хорошо пластины, вряд ли может вызывать поведение клеток недалеко от их собственного государства. Точное повторение родной сотовой микросреды, которые состоят из различных типов клеток, внеклеточной матрицы и биологически растворимых факторов в трехмерной (3D) архитектуры1,2,3 ,4, имеет важное значение для построения biomimicking тканей в пробирке для приложений в ткани инженерных, восстановительной медицины, биологии фундаментальных исследований и наркотиков обнаружения5,6,7 ,8,9.

Вместо 2D клеточной культуры 3D клеточной культуры широко используется для продвижения biomimetic микро архитектуры и функциональные особенности клетки культивировали в пробирке. Популярные 3D клетки культуры метод заключается в совокупных клетки в сфероидов7,8,9,10. Сотовый сфероидов может быть введен в поврежденных тканей с расширенной сотовой хранения и выживания, по сравнению с инъекции рассеянных клеток. Однако неоднородной сфероида размеров и неизбежных механических повреждений, введенной на клетки жидкости поперечной силы во время инъекции привести к плохой клеток терапевтические эффекты11,12,13. Аналогичным образом присущие неравномерность в ходе агрегирования сфероидов сделало их перевод в 3D на основе ячеек высок объём наркотиков скрининг сложной10.

Другой метод для 3D клеточной культуры достигается с помощью биоматериалов, который обычно инкапсулирует клетки в водный гидрогели или пористых строительных лесов. Это позволяет для большей гибкости в построении 3D архитектуры. Для терапии клетки, инкапсулированные в сыпучих строительных лесов, обычно доставляются тела животного через хирургической имплантации, который инвазивных и травматические, тем самым ограничивая его широкий перевод к постели. С другой стороны водный гидрогели включить минимально инвазивная терапия, клетки, приостановлено в растворе прекурсоров гидрогеля в тел животных, позволяя в situ гелеобразования через термо-, химические или ферментативный сшивки11. Однако как клетки доставляются хотя гидрогеля прекурсоров находятся все еще в состоянии водный, они также подвергаются механической сдвига во время инъекции. Не только так химических или ферментативный сшивки во время гелеобразования в situ гидрогеля также может наложить повреждения клеток внутри. Для скрининга наркотиков, при содействии биоматериала клеточных культур сталкиваются с проблемами с единообразия, управляемость и пропускную способность. С помощью гидрогели, клетки обычно участвуют во время гелеобразования, в которой процесс может повлиять на жизнеспособность клеток и функции. Гелеобразование во время заполнения ячейки также препятствует использование большинства высокопроизводительного оборудования, так как Гидрогель может потребоваться храниться на льду для предотвращения гелеобразования до заполнения ячейки, и гидрогеля возможно застревание дозирования советы, которые обычно очень тонкие, чтобы обеспечить точность для высокопроизводительного скрининга. Предварительно сформированных леса могут потенциально отдельных процедур изготовления биоматериала из клеточной культуры, однако большинство продуктов на основе эшафот доступны как сыпучих материалов с относительно низкой пропускной способности14.

Чтобы преодолеть некоторые из недостатков нынешних методов 3D культуры, мы разработали микротехнологий cryogelation интегрированные технологии для изготовления готовых и удобный microcryogel массив чип15. В этом протоколе желатин выбран иллюстрируют технология изготовления microcryogel как это биосовместимых, разложению, экономически эффективным, и никаких дальнейших изменений требуется для клеток вложения. Другие полимеры природные или синтетические источники также могут использоваться для изготовления, в зависимости от приложения. Через эту технологию мы можем изготовить миниатюрных и Высокоэластичный microcryogels с контролируемый размер, форму и структуру. При загрузке с различных типов клеток, 3D microtissues может быть сформирован для различных приложений. Эти уникальные особенности включить желаемый injectability, Защита ячеек и ориентированные на сайте удержания после инъекции в естественных условиях для расширения терапевтические эффекты. Это не только так microcryogels может быть дополнительно обработаны для формирования 3D microtissue массивов, которые совместимы с общей лабораторное оборудование и инструменты для реализации высокопроизводительных клеточной культуры для скрининга универсальный наркотиков и других клеточных анализов. Здесь мы будем подробно процесс изготовления microcryogels и ее после лечения как отдельные 3D microtissues или 3D microtissue массивы для двух важных приложений, клеточной терапии и наркотиков скрининг, соответственно10,15 .

Protocol

эксперименты на животных следуют строгим протокол, утвержденных Комитетом по этике животное на центр биомедицинских анализ, Университет Цинхуа. Соответствии с одобрения Комитета по этике, жировых тканях человека была получена из Департамент пластической хирургии Peking союза больницы …

Representative Results

Изготовление и характеристика microcryogels для формирования 3D microtissue. Согласно протоколу microcryogels были изготовлены формы 3D microtissues и отдельных microcryogels или microcryogel массивы и были применены к восстановительной терапии и наркотиков скри…

Discussion

Регенеративной медицины и в пробирке модели для скрининга наркотиков являются два важных приложений для ткани инженерных5,6,,78,9. Хотя эти два приложения имеют весьма различные потребности, точ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была финансово поддержана Национальный фонд естественных наук Китая (грантов: 81522022, 51461165302). Авторы хотели бы признать все члены лаборатории Du для помощи общего назначения.

Materials

Gelatin sigma G7041 All other reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) unless otherwise indicated.
Glutaraldehyde  J&K 902042 Used as crosslinker in preparation of material.
Glass cover slip (24X50mm) CITOGLASS, China 10212450C To scrape prcursor solution onto microstencils array chips.
Sodium borohydride, NaBH4 Beijing Chemical Works 116-8 To wash remaining glutaraldehyde away after gelation.
Vacuum jar asperts, China VC8130 To preserve microgels under vacuum.
Polymethylmethacrylate (PMMA) sheets  Sunjin Electronics Co., Ltd, China Ordinary PMMA sheets.
Rayjet laser system Rayjet, Australia Rayjet 50 C30 To engrave PMMA sheets to form wells.
Plasma Cleaner Mycro Technologies, USA PDC-32G To make PMMA hyphophilic.
Lyophilizer Boyikang, China SC21CL To lyophilize materials.
Trypan Blue solution (0.4%) Zhongkekeao, China DA0065 To dye microgels.
Doxorubicin hydrochloride ENERGY CHEMICAL, China A01E0801360010 To test drug resistance of cells in 2D or 3D microgel.
Live/dead assay Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan) CS01-10 To distinguish alive and dead cells.
Cell Titer-Blue Promega (Wisconsin, USA). G8080 To test cell viability.
Cell strainer BD Biosciences, USA 352360 To collect microgels.
D-Luciferin SYNCHEM (Germany) s039 To tack cells.
Scanning electron microscope FEI, USA Quanta 200 To characterize microgel morphology.
 Mechanical testing machine Bose, USA 3230 To measure mechanical features.
Programmable syringe pump  World Precision Instruments, USA ALADINI 1000 To test injactabiliy.
Digital force gauge HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China H-50  To test injactabiliy.
Ethylene oxide sterilization system Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC AN74i To sterilize microgels with ethylene oxide gas.
Microplate reader Molecular Devices,USA M5 To measure fluorescence intensity in micro-array.
Confocal microscope Nikon, Japan A1Rsi To observe cell distribution in 3D.
Xenogen  Lumina II imaging system Caliper Life Sciences, USA IVIS To track cell in animals.
Liquid work stataion Apricot design,USA S-pipette To load medium or cell suspension high-throuputly.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  2. Abbott, A. Cell culture: biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  3. Loessner, D., et al. Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells. Biomaterials. 31 (32), 8494-8506 (2010).
  4. Fischbach, M. A., Bluestone, J. A., Lim, W. A. Cell-based therapeutics: the next pillar of medicine. Sci Transl Med. 5 (179), 179 (2013).
  5. Kuraitis, D., Giordano, C., Ruel, M., Musaro, A., Suuronen, E. J. Exploiting extracellular matrix-stem cell interactions: a review of natural materials for therapeutic muscle regeneration. Biomaterials. 33 (2), 428-443 (2012).
  6. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discov Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  7. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay Drug Dev Technol. 11 (7), 435-448 (2013).
  8. Yoshii, Y., et al. High-throughput screening with nanoimprinting 3D culture for efficient drug development by mimicking the tumor environment. Biomaterials. 51, 278-289 (2015).
  9. Li, X., et al. Micro-scaffold array chip for upgrading cell-based high-throughput drug testing to 3D using benchtop equipment. Lab Chip. 14 (3), 471-481 (2014).
  10. Qi, C., Yan, X., Huang, C., Melerzanov, A., Du, Y. Biomaterials as carrier, barrier and reactor for cell-based regenerative medicine. Protein Cell. 6 (9), 638-653 (2015).
  11. Li, Y., et al. Primed 3D injectable microniches enabling low-dosage cell therapy for critical limb ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (37), 13511-13516 (2014).
  12. Liu, W., et al. Magnetically controllable 3D microtissues based on magnetic microcryogels. Lab Chip. 14 (15), 2614-2625 (2014).
  13. Zhao, S., Zhao, H., Zhang, X., Li, Y., Du, Y. Off-the-shelf microsponge arrays for facile and efficient construction of miniaturized 3D cellular microenvironments for versatile cell-based assays. Lab Chip. 13 (12), 2350-2358 (2013).
  14. Liu, W., et al. Microcryogels as injectable 3-D cellular microniches for site-directed and augmented cell delivery. Acta Biomater. 10 (5), 1864-1875 (2014).
  15. Hakanson, M., et al. Controlled breast cancer microarrays for the deconvolution of cellular multilayering and density effects upon drug responses. PLoS One. 7 (6), e40141 (2012).
  16. Du, Y., et al. Rapid generation of spatially and temporally controllable long-range concentration gradients in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (6), 761-767 (2009).
  17. He, J., et al. Microfluidic synthesis of composite cross-gradient materials for investigating cell-biomaterial interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (1), 175-185 (2011).
  18. Zeng, Y., et al. Preformed gelatin microcryogels as injectable cell carriers for enhanced skin wound healing. Acta Biomater. 25, 291-303 (2015).
  19. Yang, F., et al. Genetic engineering of human stem cells for enhanced angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (8), 3317-3322 (2010).
  20. Zhang, L., et al. Delayed administration of human umbilical tissue-derived cells improved neurological functional recovery in a rodent model of focal ischemia. Stroke. 42 (5), 1437-1444 (2011).
  21. Kinnaird, T., et al. Local delivery of marrow-derived stromal cells augments collateral perfusion through paracrine mechanisms. Circulation. 109 (12), 1543-1549 (2004).
  22. Fischbach, C., et al. Engineering tumors with 3D scaffolds. Nat Methods. 4 (10), 855-860 (2007).
  23. Dhiman, H. K., Ray, A. R., Panda, A. K. Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen. Biomaterials. 26 (9), 979-986 (2005).
  24. Gimble, J. M., Guilak, F., Bunnell, B. A. Clinical and preclinical translation of cell-based therapies using adipose tissue-derived cells. Stem Cell Res Ther. 1 (2), (2010).
  25. Thai, H. M., et al. Implantation of a three-dimensional fibroblast matrix improves left ventricular function and blood flow after acute myocardial infarction. Cell Transplant. 18 (3), 283-295 (2009).
  26. Moreira Teixeira, L. S., et al. High throughput generated micro-aggregates of chondrocytes stimulate cartilage formation in vitro and in vivo. Eur Cell Mater. 23, 387-399 (2012).
  27. Ifkovits, J. L., et al. Injectable hydrogel properties influence infarct expansion and extent of postinfarction left ventricular remodeling in an ovine model. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (25), 11507-11512 (2010).
  28. Murphy, A. R., Laslett, A., O’Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomater. , (2017).
  29. Cheng, V., et al. High-content analysis of tumour cell invasion in three-dimensional spheroid assays. Oncoscience. 2 (6), 596-606 (2015).
  30. Huber, J. M., et al. Evaluation of assays for drug efficacy in a three-dimensional model of the lung. J Cancer Res Clin Oncol. 142 (9), 1955-1966 (2016).
  31. Lamichhane, S. P., et al. Recapitulating epithelial tumor microenvironment in vitro using three dimensional tri-culture of human epithelial, endothelial, and mesenchymal cells. BMC Cancer. 16, 581 (2016).
  32. Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
  33. Monjaret, F., et al. Fully Automated One-Step Production of Functional 3D Tumor Spheroids for High-Content Screening. J Lab Autom. 21 (2), 268-280 (2016).
  34. Shologu, N., et al. Recreating complex pathophysiologies in vitro with extracellular matrix surrogates for anticancer therapeutics screening. Drug Discov Today. 21 (9), 1521-1531 (2016).
  35. Ho, W. J., et al. Incorporation of multicellular spheroids into 3-D polymeric scaffolds provides an improved tumor model for screening anticancer drugs. Cancer Sci. 101 (12), 2637-2643 (2010).
  36. Pathak, A., Kumar, S. Independent regulation of tumor cell migration by matrix stiffness and confinement. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (26), 10334-10339 (2012).
  37. Wei, S. C., et al. Matrix stiffness drives epithelial-mesenchymal transition and tumour metastasis through a TWIST1-G3BP2 mechanotransduction pathway. Nat Cell Biol. 17 (5), 678-688 (2015).
  38. Romero-Lopez, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
  39. Xu, X., Sabanayagam, C. R., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Jia, X. A hydrogel-based tumor model for the evaluation of nanoparticle-based cancer therapeutics. Biomaterials. 35 (10), 3319-3330 (2014).
  40. Xu, X., et al. Recreating the tumor microenvironment in a bilayer, hyaluronic acid hydrogel construct for the growth of prostate cancer spheroids. Biomaterials. 33 (35), 9049-9060 (2012).
  41. Nyga, A., Loizidou, M., Emberton, M., Cheema, U. A novel tissue engineered three-dimensional in vitro colorectal cancer model. Acta Biomater. 9 (8), 7917-7926 (2013).
  42. Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochem Biophys Res Commun. 433 (3), 327-332 (2013).
  43. Hoare, T. R., Kohane, D. S. Hydrogels in drug delivery: Progress and challenges. Polymer. 49 (8), 1993-2007 (2008).
  44. Delgado, L. M., Bayon, Y., Pandit, A., Zeugolis, D. I. To cross-link or not to cross-link? Cross-linking associated foreign body response of collagen-based devices. Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 298-313 (2015).
  45. Florczyk, S. J., et al. Porous chitosan-hyaluronic acid scaffolds as a mimic of glioblastoma microenvironment ECM. Biomaterials. 34 (38), 10143-10150 (2013).
  46. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
  47. Zhang, M., Boughton, P., Rose, B., Lee, C. S., Hong, A. M. The use of porous scaffold as a tumor model. Int J Biomater. 2013, 396056 (2013).
  48. Wang, J., et al. Engineering EMT using 3D micro-scaffold to promote hepatic functions for drug hepatotoxicity evaluation. Biomaterials. 91, 11-22 (2016).

Tags

Regenerative TherapyDrug ScreeningCryogelationGelatinMicrocryogelsPMMA MicrostencilPDMS Ejector PinLyophilizationHigh-throughput

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Li, Y., Yan, X., Liu, W., Zhou, L., You, Z., Du, Y. 3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening. J. Vis. Exp. (128), e55982, doi:10.3791/55982 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image