メソッドおよびアデノ随伴ウイルス ラットの静脈内投与と中枢神経系の伝達の評価のためのヒント
Summary
ラットにおける広域中枢神経系遺伝子導入法を説明します。この例では目的は脊髄全体に影響を与える疾患を模倣するためです。広範な伝達は一時、周辺の管理からして中枢神経系治療用タンパク質を提供する使用できます。
Abstract
アデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターでは、定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR)、オプトジェネティクス、cre lox ターゲットなどをクラスター化、神経科学の主試薬です。本稿の目的は、AAV の尾静脈注射を介してラットにおける広大な中枢神経系 (CNS) 遺伝子導入を試みている調査官を支援するためにです。広範な病理学の条件に関連する大規模な式をその大きいサイズとマウスと比較された人間に生理学的な類似性のため重要なラット モデル。この例のアプリケーションでは、大規模な神経伝達を使用して、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、脊髄全体に影響を与える神経変性疾患を模倣します。効率的な大規模な中枢神経系の情報伝達は、前臨床試験で治療上の蛋白質の要因を提供する使用できます。数週間の後注入式間隔の後、伝達の効果が評価されます。緑色蛍光タンパク質 (GFP) の制御ベクトルの小脳の GFP の量は基本的なイメージング プログラムによって、迅速かつ確実に推定されます。ALS によって誘導される運動疾患表現型関連タンパク質 transactive 応答 43 kDa (TDP-43) の DNA 結合タンパク質は、赤字脱出反射と rotarod で獲得しています。疾患モデル作製、遺伝子治療以外に、ここで説明した大規模な遺伝子ターゲットの潜在的な用途があります。このメソッドの利用拡大は、神経科学と川和で仮説を迅速に役立ちます。
Introduction
組換えアデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターでは、あまり生体内でのニューロンの伝達効率がよく、中枢神経系研究のための不可欠なツールです。AAV のベクトルが異なる遺伝子とタンパク質アイソ フォーム、さまざまな組織、別のホスト種、および管理の別の路線を勉強のため非常に汎用性。周辺は、比較的非侵襲、ニューロン中枢神経系全体を最初に変換する静脈注射の記載・ フォウストらとドゥケらによってマウスに AAV を管理ことができますたとえば、(を参照してくださいゼウス紙 Gombash et al.(2014 年))。1,2,3この遺伝子配信アプローチをどちらかの緑色蛍光タンパク質 (GFP) を効率的に表現するラットの使用または ALS 関連タンパク, transactive 応答 43 kDa (TDP-43) 中枢神経系の DNA 結合タンパク質。4,5,6,7,8,9ラットでの作業は、ラットの代謝および生理学的パラメーターはマウスと比べて人間に近い、行動および毒性学的試金のラットのために特別に設計されていますので重要です。さらより多くの遺伝子組み換えラット線が可能になっている AAV 遺伝子伝達研究で利用可能します。
メソッドは、ラットと成果の迅速で信頼性の高い定量広大な中枢神経系遺伝子伝達の詳細です。大規模な中枢神経系の情報伝達は、TDP 43 脊髄全体に表現することによってラットの ALS の症状を模倣する使用されます。メソッドが使用されるジャクソンら若いラットに TDP 43 ベクトルの尾静脈注射6,8,2 つの方法で獲得した TDP 43 による運動障害が数週間後、 9 : 反射と rotarod と、デイトンら・ ジャクソンらとエスケープ5,6,7,9制御 GFP ベクトル、事後分析での小脳の蛍光の面積はジャクソンらにおいて伝達効率の指標として計算は6,8小脳の解析周辺遺伝子デリバリー後中枢神経系伝達性の迅速かつ信頼性の高いインデックスをあると証明したし、さまざまな周辺機器、中央へ遺伝子導入を試みるアプローチを適用する必要があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
AAV ベクターの様々 な配送ルートをテストされている: イントラ実質、内 cerebroventricular、内莢膜、静脈内、鼻腔内、筋肉内、等。各ルートは、特定の利点と欠点があります。成人ラット AAV の尾静脈投与は中枢神経系の一貫性のある情報伝達を実現するための信頼性の高い方法です。末梢注入方法注入カニューレの中枢神経組織への導入を回避、低侵襲。このメソッドによって達成することが…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ALS 協会、Karyopharm ・ セラピューティクス社、Meira GTx、感謝しております、トーマス ・ ローソンから ALS 研究慈善寄付によって賄われていた。アドバイスやトレーニング、エリスの果樹園とドナ バーニーに感謝します。JAS が嘘をついた財団によって支えられたし、健康の国民の協会は GM103418 を付与します。
Materials
| Scale | Pelouze | SP5 | |
| Nalgene bucket | Thermo Scientific | 12014000 | 4000 mL |
| Microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Lactated Ringer's Solution | Baxter Healthcare | 0338-0114-04 | |
| Mini vortexer | Fisher Scientific | 128101 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 22624415 | |
| Laboratory film | Bemis | PM996 | |
| 1-mL syringe | BD | 309626 | Comes with a 25g needle attached. Replace with 27-30g needle for injection |
| 30g needle | BD | 305106 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | Isoflurane USP 250 mL |
| Anesthesia mask | Kopf Instruments | 906 | |
| Gauze | Henry Schein | 100-2524 | 2" x 2" (5cm x 5cm) |
| Pipet tips | USA Scientific | 1111-0816 | |
| Micropipet | Gilson | 4642080 | |
| Gas anesthesia vaporizer | SurgiVet | 4214322 | Classic T3 |
| Gas anesthesia scavenger | SurgiVet | 32373B10 | Enviro-PURE |
| Heating pad | Sears | 17280 | |
| Bench pad | VWR | 56617-006 | |
| Rotarod | Panlab/Harvard Apparatus | 76-0772 | 4 rats/ 4 mice |
| 70% Ethanol | Decon Laboratories, Inc. | 2401 | 140 proof |
| 70% Isopropanol | VWR | 89108-160 | |
| Scion Image | Scion Corporation | ||
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Invitrogen | A11122 | Primary Antibody – 1:500 dilution |
| AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11070 | Secondary Antibody – 1:300 dilution |
| Axioskop 40 microscope | Zeiss |
References
- Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
- Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
- Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037 (2014).
- Wang, D., et al. Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed. Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).
- Dayton, R., et al. Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis. Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).
- Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036 (2015).
- Jackson, K., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis. Gene Therapy. 22 (1), 20-28 (2015).
- Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B. Front. Mol. Neurosci. 9, 116 (2016).
- Jackson, K., et al. Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats. BMC Neuroscience. 17 (1), 69 (2016).
- Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
- Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. Gene vector "magic bullet": targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter. Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).
- van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. Gas embolism: pathophysiology and treatment. Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23 (5), 237-246 (2003).
