Intrasplenic трансплантация гепатоцитов после частичной гепатектомии в Нод. ТКИД мышей
Summary
Мы описали протокол для выполнения частичной гепатектомии (ФСК) и трансплантации клеток через селезенку в Нод. ТКИД (НОД. CB17-Prkdcscid/j) мышах. В этом протоколе разрез делается разоблачить и иссечения левой доли печени, последовал еще один разрез intrasplenic трансплантации клеток.
Abstract
Частичной гепатектомии является универсальным и воспроизводимый метод для изучения регенерации печени и эффект терапии на основе клеток при различных патологических состояниях. Частичной гепатектомии также облегчает увеличение приживления и распространение пересаженные клетки путем ускорения неоваскуляризации и миграции клеток к печени. Здесь мы опишем простой протокол для выполнения 30% гепатектомии и трансплантации клеток в селезенке-ожирением диабетом/тяжелой объединены иммунодефицитных КИВНУЛ. ТКИД (НОД. CB17-Prkdcscid/j) мыши.
В этой процедуре две небольшие надрезы. Первый разрез разоблачить и иссечения левой доли печени, и еще один небольшой надрез подвергать intrasplenic трансплантации клеток селезенки. Эта процедура не требует каких-либо специализированных хирургических навыков, и она может быть завершена в течение 5-7 минут с меньше стресса и боли, быстрого восстановления и лучше выживания. Мы продемонстрировали трансплантации гепатоцитов, изолированных от Зеленый флуоресцирующий белок (КГВ), выражая мыши (трансгенные C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), а также гепатоцитов как клетки человеческого происхождения (NeoHep) в частично hepatectomized КИВНУЛ. ТКИД мышей.
Introduction
В настоящее время гепатоцит трансплантации предлагается в качестве альтернативы весь трансплантации для лечения пациентов, имеющих серьезные расстройства печени. Считается, что он может преодолеть пациентам весь орган трансплантации1. Помимо аллогенной гепатоцитов2,3 ксеногенные гепатоцитов и гепатоцитов, производный от стволовых клеток4 изучаются также в животных моделях. В этом контексте, головка самонаведения и приживления потенциал пересаженные клетки в получателя является важным критерием для основе клеточной терапии в острой печеночной недостаточности (ОСН).
Для расследования трансплантации гепатоцитов или гепатоцито подобных клеток5, осн создается в животной модели либо хирургического6 или фармакологических7 процедуры по пересадке клеток. Чтобы сделать AHF животной модели фармакологических реагентов, многие гепатотоксинов d-galactosamine8, ацетаминофен9, тетрахлорид углерода10, thioacetamide11, конканавалина А12, липополисахарида13 , и т.д., были использованы. Из этого списка каждый реагент генерирует уникальный набор функций для осн, но к сожалению без единого реагент имитирует человеческое осн. Кроме того ОСН, вызванных гепатотоксинов занимает длительное время, которое ставит животных под хронический стресс, и трудно получить воспроизводимые результаты.
С другой стороны хирургическая процедура частичной гепатектомии (ФСК) это зависит от мастерства, и воспроизводимые результаты легко получить после разработки необходимых навыков. Чтобы побудить AHF путем хирургического вмешательства только, требуется резекция печени более чем на 70%; Однако меньше, чем 70% гепатектомии все еще могут быть использованы для исследования приживления и распространением пересаженные клетки в печени для анализа их терапевтический потенциал во время повреждения печени14. Трансплантация гепатоцитов были гепатектомии выполненных пост через брюшины15, хвост вен16, печеночная Вена17или селезенки18. В настоящее время печеночная Вена инфузии и intrasplenic трансплантация гепатоцитов являются предпочтительным процедуры, как они проще воспроизвести.
В этой статье мы описали процедуру для 30% частичной гепатектомии в Нод. ТКИД (НОД. CB17-Prkdcscid/J) мышах, в которых вырезана левой доли печени. Это сопровождается трансплантации 0,2 млн GFP-выражая гепатоцитов мыши (C57BL/6-Tg (UBC-GFP) 30Scha/J), а также человеческого происхождения19 NeoHep в селезенке. Эта процедура приводит к приживления пересаженных клеток в печени. Эта процедура является наименее инвазивных и минимально болезненной технику.
Protocol
Representative Results
Discussion
Частичной гепатектомии является установленным техника для расследования регенерации печени, и сообщается, что чрезмерное гепатектомии имитировать модель осн. Среди животных моделей AHF грызунов, особенно мышей, являются наиболее исследуемой модели. Чтобы получить модель повреждения ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана основных грантов, полученных из Департамента биотехнологии, правительство Индии Национальный Институт иммунологии, Нью-Дели. Д-р Бхаттачарджи текущий адрес является Отдел гастроэнтерологии, гепатологии и питания, Детская больница Лос-Анджелеса.
Materials
| Gas Anesthesia System | Ugo Basile; Italy | 211000 | |
| Weighing machine | Goldtech ; India | Local Procurement | |
| Biological safety cabinet ( Class I) | Kartos international; India | Local Procurement | |
| Hair Trimmer | Panasonic ; Japan | ER-GY10 | |
| Straight operating scissor with sharp /sharp blades | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Forceps with Serrations | Major Surgicals; India | Local Procurement | |
| Micro needle holders straight & curved | Mercian ; England | BS-13-8 | |
| 1 ml insulin syringe with 30G *5/16 needles | Dispo Van; India | ||
| 1 ml syringe with 26 G * 1/2 needle | BD ; US | REF 303060 | |
| Nylon Threads | Mighty ; India | (1-0) Local Procurement | |
| MERSUTURES 4-0 Sterilised Surgical Needled Suture | Ethicon, Johnson & Johnson, India | NW 5047 | |
| TRUGUT 76 cm 4-0 absorbable surgical suture | Sutures India Pvt. Ltd; India | SN 5048 | Sterilised Surgical Needled Suture Catgut Chromic |
| Cotton Buds | Pure Swabs Pvt Ltd ; India | Local Procurement | |
| Surgical Tape | 3M India ; India | 1530-1 | Micropore Surgical Tape |
| Microtome | Histo-Line Laboratories, Italy | MRS3500 | |
| Shandon Cryotome E Cryostat | Thermo Electron Corporation ; US | ||
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss ; Germany | LSM 510 META | |
| Bright Field Microscope | Olympus, Japan | LX51 | |
| Automated analyser | Tulip, Alto Santracruz, India | Screen Maaster 3000 | Biochemical analyser for liver functional test |
| Flow Cytometer | BD ; US | BD FACSverse | Assesment of presence of cells post transplantation |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benckiser , India | ||
| FORANE | Abbott ; US | isoflurane USP 99.9% | |
| Taxim | AlKem ; India | cefotaxime sodium injection | |
| Povidone-Iodine solution | Win-Medicare; India | Betadine | |
| Paraformaldehyde | Himedia; India | GRM 3660 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | 12200-036 | |
| Sucrose | Sigma ; US | S0389 | |
| Tissue-Tek | Sakura; US | 25608-930 | O.C.T compound |
| DAPI | Himedia; India | MB 097 | |
| anti-Albumin goat Polyclonal | Thermo Scientific,Pierce, US | PA126081 | |
| anti-connexin 32/GJB1 Polyclonal | abcam, UK | ab64609-500 | |
| antiGFP rabbit polyclonal | Santa Cruz biotechnology; US | SC 8334 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-goat | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11058 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A11015 | |
| Alexa Fluor 594 chicken anti rabbit | Molecular Probes , Thermo Fisher Scientific ; US | A21442 | |
| Goat anti rabbit IgG HRP | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific; US | 65-6120 | |
| anti-Ki67 antibody | abcam, UK | ab15580 | |
| Antigen Unmasking Solution, Citric acid base | Vector laboratories, US | H-3300 | |
| ProLong Diamond antifade mountant | Life technologies, Thermo Fisher scientific ; US | P36966 | |
| SGOT (ASAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| SGPT (ALAT) KIT | Coral Clinical System, India | ||
| Alkaline Phosphatase Kit (DEA) | Coral Clinical System, India | ||
| Hematoxylin Solution, Mayer's | Sigma ; US | MHS16 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma ; US | HT110132 | |
| DPX Mountant | Sigma ; US | 6522 | |
| Melonex (Pain Killer) | Intas Pharmaceuticals Ltd; India | Meloxicam injection | |
| DAB enhanced liquid substrate system tetrahydrochloride | Sigma ; US | D3939 |
References
- Nussler, A., et al. Present status and perspectives of cell-based therapies for liver diseases. J. Hepatol. 45 (1), 144-159 (2006).
- Ponder, K. P., et al. Mouse hepatocytes migrate to liver parenchyma and function indefinitely after intrasplenic transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (4), 1217-1221 (1991).
- Kokudo, N., Horimoto, H., Ishida, K., Takahashi, S., Nozawa, M. Allogeneic hepatocyte and fetal liver transplantation and xenogeneic hepatocyte transplantation for Nagase’s analbuminemic rats. Cell Transplant. 5 (5 Suppl 1), S21-S22 (1996).
- Christ, B., Bruckner, S., Stock, P. Hepatic transplantation of mesenchymal stem cells in rodent animal models. Methods Mol. Biol. 698, 315-330 (2011).
- Fox, I. J., Roy-Chowdhury, J. Hepatocyte transplantation. J. Hepatol. 40 (6), 878-886 (2004).
- Glanemann, M., et al. Transplantation of monocyte-derived hepatocyte-like cells (NeoHeps) improves survival in a model of acute liver failure. Ann. Surg. 249 (1), 149-154 (2009).
- Rahman, T. M., Hodgson, H. J. Animal models of acute hepatic failure. Int. J. Exp. Pathol. 81 (2), 145-157 (2000).
- Zhang, L., et al. Granulocyte colony-stimulating factor treatment ameliorates liver injury and improves survival in rats with D-galactosamine-induced acute liver failure. Toxicol. Lett. 204 (1), 92-99 (2011).
- Gardner, C. R., et al. Role of nitric oxide in acetaminophen-induced hepatotoxicity in the rat. Hepatology. 27 (3), 748-754 (1998).
- Nardo, B., et al. Successful treatment of CCL4-induced acute liver failure with portal vein arterialization in the rat. Transplant Proc. 38 (4), 1187-1189 (2006).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Fulminant hepatic failure in rats induces oxidative stress differentially in cerebral cortex, cerebellum and pons medulla. Neurochem. Res. 32 (3), 517-524 (2007).
- Wu, J., et al. Laennec protects murine from concanavalin A-induced liver injury through inhibition of inflammatory reactions and hepatocyte apoptosis. Biol. Pharm. Bull. 31 (11), 2040-2044 (2008).
- Kaur, G., Tirkey, N., Chopra, K. Beneficial effect of hesperidin on lipopolysaccharide-induced hepatotoxicity. Toxicology. 226 (2-3), 152-160 (2006).
- Rupertus, K., et al. Major but not minor hepatectomy accelerates engraftment of extrahepatic tumor cells. Clin. Exp. Metastasis. 24 (1), 39-48 (2007).
- Selden, C., Casbard, A., Themis, M., Hodgson, H. J. Characterization of long-term survival of syngeneic hepatocytes in rat peritoneum. Cell Transplant. 12 (6), 569-578 (2003).
- Tang, T. H., et al. The role of donor hepatocytes and/or splenocytes pre-injection in reducing islet xenotransplantation rejection. Hepatobiliary. Pancreat. Dis. Int. 2 (3), 344-350 (2003).
- Goto, Y., Ohashi, K., Utoh, R., Yamamoto, M., Okano, T. Hepatocyte transplantation through the hepatic vein: a new route of cell transplantation to the liver. Cell Transplant. 20 (8), 1259-1270 (2011).
- Gabelein, G., et al. Intrasplenic or subperitoneal hepatocyte transplantation to increase survival after surgically induced hepatic failure?. Eur. Surg. Res. 41 (3), 253-259 (2008).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived From Chronic Hepatitis B Virus Patients’ Blood Monocytes by Upregulation of cMET Signaling. Stem Cells Transl. Med. , (2016).
- . . Basic surgical skills. Emergency and Essential Surgical Care (EESC) programme. , (2017).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Lee, S. M., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. Isolation of human hepatocytes by a two-step collagenase perfusion procedure. J. Vis. Exp. (79), (2013).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. J. Vis. Exp. (64), (2012).
- Bhattacharjee, J., et al. Autologous NeoHep Derived from Chronic Hepatitis B Virus Patients’ Blood Monocytes by Upregulation of c-MET Signaling. Stem Cells Transl. Med. 6 (1), 174-186 (2017).
- Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann. Gastroenterol. 24 (4), 307-318 (2011).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18 (22), 2767-2774 (2012).
- Vidal, I., Richert, L. The nude mouse as model for liver deficiency study and treatment xenotransplantation. Int. J. Hepatol. , 1400147 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. J. Vis. Exp. (79), e50544 (2013).
- Krikri, A., et al. Laparoscopic vs. open abdominal surgery in male pigs: marked differences in cortisol and catecholamine response depending on the size of surgical incision. Hormones (Athens). 12 (2), 283-291 (2013).
