Summary

Détermination du contenu en glycogène dans les cyanobactéries

Published: July 17, 2017
doi:

Summary

Ici, nous présentons un dosage fiable et facile pour mesurer la teneur en glycogène dans les cellules cyanobactériennes. La procédure implique des précipitations, une dépolymérisation sélectionnable et la détection de résidus de glucose. Cette méthode est appropriée pour les souches de type sauvage et génétiquement modifiées et peut faciliter l'ingénierie métabolique des cyanobactéries.

Abstract

Les cyanobactéries accumulent du glycogène comme stockage majeur de carbone et d'énergie intracellulaire pendant la photosynthèse. Les développements récents dans la recherche ont mis en évidence des mécanismes complexes du métabolisme du glycogène, y compris le cycle diels de la biosynthèse et du catabolisme, la régulation redox et l'implication de l'ARN non codant. Dans le même temps, des efforts sont faits pour rediriger le carbone du glycogène vers des produits désirables dans des cyanobactéries génétiquement modifiées pour améliorer les rendements des produits. Plusieurs méthodes sont utilisées pour déterminer le taux de glycogène dans les cyanobactéries, avec des précisions variables et des complexités techniques. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la détermination fiable de la teneur en glycogène dans les cyanobactéries qui peuvent être effectuées dans un laboratoire de sciences de la vie standard. Le protocole implique la précipitation sélective du glycogène à partir du lysat cellulaire et la dépolymérisation enzymatique du glycogène pour générer des monomères de glucose, qui sont détectés par un bœuf de glucoseIdase-peroxydase (GOD-POD) couplé à l'enzyme. La méthode a été appliquée à Synechocystis sp. PCC 6803 et Synechococcus sp. PCC 7002, deux types d'espèces de cyanobactéries largement utilisées dans l'ingénierie métabolique. En outre, la méthode a montré avec succès des différences dans les teneurs en glycogène entre le type sauvage et les mutants défectueux dans les éléments régulateurs ou les gènes de biosynthèse du glycogène.

Introduction

Les cyanobactéries accumulent du glycogène comme principal stock de glucides provenant du CO 2 fixé à la lumière par la photosynthèse. Le glycogène est un glycan consistant en un glucane linéaire α-1,4-lié avec des branches créées par des liaisons glucosyle liées à l'α-1,6. La biosynthèse du glycogène dans les cyanobactéries commence par la conversion du glucose-6-phosphate en ADP-glucose par l'action séquentielle de la phosphoglucomutase et de la pyrophosphorylase ADP-glucose. La fraction de glucose dans ADP-glucose est transférée à l'extrémité non réductrice du squelette α-1,4-glucane du glycogène par une ou plusieurs glycogènes synthases (GlgA). Par la suite, des enzymes de ramification introduisent la liaison glucosyle liée à l'α-1,6, qui est encore étendue pour générer la particule de glycogène. Dans le noir, le glycogène est décomposé par la glycogène phosphorylase, les enzymes débranchantes du glycogène, l'α-glucanotransférase et la malto-dextrine phosphorylase dans le glucose phosphorylé et le glucose libre. Ces flux intLes voies cataboliques, y compris la voie de phosphate de pentose oxydante, la voie d'Embden-Meyerhof-Parnas (glycolyse) et la voie de Entner-Doudoroff 1 , 2 , 3 , 4 .

Le métabolisme du glycogène dans les cyanobactéries a suscité un intérêt croissant au cours des dernières années en raison de la possibilité que les cyanobactéries se développent dans des usines de cellules microbiennes entraînées par la lumière du soleil pour produire des produits chimiques et des combustibles. Le métabolisme du glycogène pourrait être modifié pour augmenter le rendement des produits, car le glycogène est le plus grand pool de carbone flexible de ces bactéries. Un exemple est la cyanobactérie Synechococcus sp. PCC 7002, qui a été génétiquement conçu pour produire du mannitol; La rupture génétique de la synthèse du glycogène augmente le rendement en mannit 3 fois 5 . Un autre exemple est la production de bioéthanol à partir de cellules sauvages chargées de glycogèneYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . La teneur en glycogène des cellules de type sauvage peut représenter jusqu'à 60% du poids sec de la cellule pendant la famine par l'azote 6 .

Notre compréhension du métabolisme et de la régulation du glycogène a également été élargie ces dernières années. Alors que le glycogène est connu pour s'accumuler dans la lumière et être catabolisé dans l'obscurité, la cinétique détaillée du métabolisme du glycogène pendant le cycle diel n'a été révélée que récemment dans Synechocystis sp. PCC 6803 7 . En outre, plusieurs gènes affectant l'accumulation de glycogène ont été identifiés. Un exemple notable est la découverte que la putative histidine kinase PmgA et l'ARN non codant PmgR1 forment une cascade régulatrice et contrôlent l'accumulation de glycogène. Fait intéressant, les mutants de suppression de pmgA et pmgR1 accumulent deux fois plus de glycogène que la souche de type sauvage de Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 . D'autres éléments réglementaires sont également connus pour affecter l'accumulation de glycogène, y compris le facteur de sigma alternatif E et le facteur de transcription CyAbrB2 10 , 11 .

À mesure que l'intérêt pour la régulation du glycogène et le métabolisme augmente, un protocole détaillé décrivant la détermination de la teneur en glycogène est justifié. Plusieurs méthodes sont utilisées dans la littérature. L'hydrolyse acide suivie de la détermination de la teneur en monosaccharides par une chromatographie liquide à échange d'anions haute pression associée à un détecteur ampérométrique pulsé ou à une détermination spectrométrique après des traitements avec de l'acide et du phénol sont des méthodes largement utilisées pour rapprocher la teneur en glycogène 9 , 10 , 12 , 13 . Cependant, une chromatographie liquide à échange d'anions haute pressionL'instrument c est très coûteux et ne distingue pas le glucose dérivé du glycogène de celui dérivé d'autres glycoconjugués contenant du glucose, tels que le saccharose 14 , le glucosylglycérol 15 et la cellulose 16 , 17 , 18 , qui sont connus pour s'accumuler dans certaines espèces de cyanobactéries. La méthode acide-phénol peut être effectuée en utilisant des équipements de laboratoire standard. Cependant, il utilise des réactifs hautement toxiques et ne distingue pas le glucose dérivé de différents glycoconjugués, ni distingue le glucose des autres monosaccharides qui constituent des matériaux cellulaires tels que les glycolipides, les lipopolysaccharides et les matrices extracellulaires 12 . Notamment, le dosage acide acide-phénol est souvent utilisé pour la détermination de la teneur totale en glucides plutôt que pour la détermination spécifique de la teneur en glucose 12 . Enzymatic hyL'hydrolyse du glycogène en glucose par l'α-amyloglucosidase suivie de la détection du glucose par un dosage couplé à une enzyme génère une lecture colorimétrique hautement sensible et spécifique au glucose dérivé du glycogène. La spécificité peut être renforcée avec la précipitation préférentielle du glycogène à partir des lysats cellulaires par l'éthanol 5 , 8 , 19 .

Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour un dosage enzymatique du contenu en glycogène dans deux des espèces de cyanobactéries les plus étudiées, Synechocystis sp. PCC 6803 et Synechococcus sp. PCC 7002, dans les souches de type sauvage et mutant. Afin d'assurer une hydrolyse efficace, un cocktail d'α-amylase et d'α-amyloglucosidase est utilisé 8 . L'α-amylase à effet endo hydrolyse les liaisons α-1,4 dans divers glucanes dans les dextrines, qui sont encore hydrolysées tO glucose par ex-action de l'α-amyloglucosidase 20 . Les effets synergiques de ces enzymes sont bien connus, et ces enzymes sont habituellement utilisées pour l'hydrolyse sélective de l'amidon, qui est un glucane glycogène tel que glycogène, sans affecter d'autres glycoconjugants, comme la cellulose, dans la biomasse végétale 21 . Le glucose libéré est détecté quantitativement suite à un essai couplé par une enzyme consistant en glucose oxydase – qui catalyse la réduction de l'oxygène au peroxyde d'hydrogène et l'oxydation du glucose à une lactone et à la peroxydase – qui produit un colorant de quinoneimine de couleur rose provenant du peroxyde d'hydrogène, Un composé phénolique et la 4-aminoantipyrine 22 .

Protocol

1. Préparation Les cultures de cyanobactéries Grow Synechocystis sp. PCC 6803 à 30 ° C dans un milieu liquide BG11 8 , avec un apport constant d'air additionné de CO 2 à 1% (v / v). Illuminer les cultures en continu avec de la lumière à une densité de flux photonique photosynthétique de 50 μmol de photon / m 2 / s. Grow Synechococcus sp. PCC 7002 en liquide A + moyen 23 (m…

Representative Results

10 ml de Synechocystis sp. Le PCC 6803 a été cultivé dans des conditions photoautotrophiques jusqu'à ce que la valeur de la DO 730nm atteigne environ 0,8. Les cellules ont été récoltées et remises en suspension dans du Tris-HCl 50 mM, pH 8. La valeur de la DO730nm a été ajustée à 2-3. La teneur en glycogène a été analysée selon le protocole décrit ci-dessus. La teneur en glycogène par OD 730nm était de 13 ± 1,8 μg / mL / …

Discussion

Les étapes critiques dans le protocole sont la précipitation et la resuspension du glycogène. Après centrifugation suite à la précipitation de l'éthanol, le glycogène forme une pastille translucide qui adhère légèrement aux parois des tubes de microcentrifugeuse. Par conséquent, lors de l'élimination du surnageant, une attention particulière doit être accordée afin de ne pas enlever la pastille. La pastille de glycogène est collante, et la solubilisation peut être difficile si elle sèche. Note…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs reconnaissent Nordic Energy Research (AquaFEED, projet no 24), Innovationfonden Denmark (Pant Power, projet n ° 12-131844) et Villum Fonden (projet n ° 13363)

Materials

QSonica Sonicators Q700 Qsonica, LLC NA QSonica
SpectraMax 190 Microplate Reader  Molecular Devices NA Eliza plate reader
Bullet Blender Storm Next Advance BBY24M-CE Beads beater
Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer Amersham Biosciences NA Spectrophotometer
Tris  Sigma-Aldrich T1503 Buffer
HCl Merck 1-00317 pH adjutment
Sodium acetate Sigma-Aldrich 32319 Buffer
Amyloglycosidase (Rhizopus sp.) Megazyme E-AMGPU Enzyme for glycogen depolymerization
α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis) Sigma-Aldrich A3176 Enzyme for glycogen depolymerization
D-Glucose Merch 8337 Standard for the glucose assay
Pierce BCA Protein assay kit  Thermo Fisher scientific 23225 For determination of protein concentrations
Aluminum drying trays, disposable VWR 611-1362 For determination of cell dry weights
D-Glucose assay kit (GODPOD format) Megazyme K-GLUC For determination of glucose concentrations
Zirconium oxide breads, 0.15 mm Next Advance ZrOB015 Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm
RINO tubes Next Advance NA Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm

References

  1. Chen, X., et al. The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).
  2. Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose. Metab Eng. 4 (3), 202-216 (2002).
  3. Pelroy, R. A., Levine, G. A., Bassham, J. A. Kinetics of light-dark CO2 fixation and glucose assimilation by Aphanocapsa 6714. J Bacteriol. 128, 633-643 (1976).
  4. You, L., Berla, B., He, L., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. 13C-MFA delineates the photomixotrophic metabolism of Synechocystis. sp. PCC 6803 under light- and carbon-sufficient conditions. Biotechnol J. 9, 684-692 (2014).
  5. Jacobsen, J. H., Frigaard, N. U. Engineering of photosynthetic mannitol biosynthesis from CO2 in a cyanobacterium. Metab Eng. 21, 60-70 (2014).
  6. Möllers, K. B., Cannella, D., Jørgensen, H., Frigaard, N. -. U. Cyanobacterial biomass as carbohydrate and nutrient feedstock for bioethanol production by yeast fermentation. Biotechnol Biofuels. 7, 64 (2014).
  7. Angermayr, S. A., et al. Culturing Synechocystis. sp. strain PCC 6803 with N2 and CO 2 in a diel regime reveals multiphase glycogen dynamics with low maintenance costs. Appl Environ Microbiol. 82, 4180-4189 (2016).
  8. de Porcellinis, A. J., et al. The Non-coding RNA Ncr0700/PmgR1 is required for photomixotrophic growth and the regulation of glycogen accumulation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Cell Physiol. 57 (10), 2091-2103 (2016).
  9. Sakuragi, Y. alpha-Tocopherol plays a role in photosynthesis and macronutrient homeostasis of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that is independent of its antioxidant function. Plant Physiol. 141, 508-521 (2006).
  10. Osanai, T., et al. Positive regulation of sugar catabolic pathways in the cyanobacterium Synechocystis. sp. PCC 6803 by the group 2 sigma factor sigE. J Biol Chem. 280, 30653-30659 (2005).
  11. Yamauchi, Y., Kaniya, Y., Kaneko, Y., Hihara, Y. Physiological roles of the cyAbrB transcriptional regulator pair Sll0822 and Sll0359 in Synechocystis sp. strain PCC 6803. J Bacteriol. 193, 3702-3709 (2011).
  12. Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P., Smith, F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem. 28, 350-356 (1956).
  13. Osanai, T., et al. Genetic engineering of group 2 {sigma} factor SigE widely activates expressions of sugar catabolic genes in Synechocystis species PCC 6803. J Biol Chem. 286, 30962-30971 (2011).
  14. Miao, X., Wu, Q., Wu, G., Zhao, N. Sucrose accumulation in salt-stressed cells of agp gene deletion-mutant in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. FEMS Microbiol Letters. 218, 71-77 (2003).
  15. Hagemann, M., Erdmann, N. Activation and pathway of glucosylglycerol synthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbiology. 140, 1427-1431 (1994).
  16. Nobles, D. R., Romanovicz, D. K., Brown, R. M. Cellulose in cyanobacteria. Origin of vascular plant cellulose synthase. Plant Physiol. 127, 529-542 (2001).
  17. Zhao, C., et al. High-yield production of extracellular type-I cellulose by the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002. Cell Discovery. 1, 15004 (2015).
  18. Kawano, Y., et al. Cellulose accumulation and a cellulose synthase gene are responsible for cell aggregation in the cyanobacterium Thermosynechococcus vulcanus RKN. Plant Cell Physiol. 52, 957-966 (2011).
  19. Angermayr, S. A., Gorchs Rovira, A., Hellingwerf, K. J. Metabolic engineering of cyanobacteria for the synthesis of commodity products. Trends Biotechnol. 33, 352-361 (2015).
  20. Zhang, B., Dhital, S., Gidley, M. J. Synergistic and antagonistic effects of α-amylase and amyloglucosidase on starch digestion. Biomacromolecules. 14, 1945-1954 (2013).
  21. Harholt, J., et al. ARABINAN DEFICIENT 1 is a putative arabinosyltransferase involved in biosynthesis of pectic arabinan in Arabidopsis. Plant Physiol. 140, 49-58 (2006).
  22. Fernando, C. D., Soysa, P. Optimized enzymatic colorimetric assay for determination of hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity of plant extracts. MethodsX. 2, 283-291 (2015).
  23. Jacobsen, J. H., Rosgaard, L., Sakuragi, Y., Frigaard, N. U. One-step plasmid construction for generation of knock-out mutants in cyanobacteria: studies of glycogen metabolism in Synechococcus sp PCC 7002. Photosynth Res. 107 (2), 215-221 (2011).
  24. Lichtenthaler, H. K. Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes. Methods Enzymol. 148, 350-382 (1987).
  25. López, C. V. G., del Carmen Cerón García, M., Fernández, F. G. A., Bustos, C. S., Chisti, Y., Sevilla, J. M. F. Protein measurements of microalgal and cyanobacterial biomass. Bioresource Technol. 101, 7587-7591 (2010).
  26. Hasunuma, T., et al. Dynamic metabolic profiling of cyanobacterial glycogen biosynthesis under conditions of nitrate depletion. J Exp Bot. 64, 2943-2954 (2013).
  27. Díaz-Troya, S., López-Maury, L., Sánchez-Riego, A. M., Roldán, M., Florencio, F. J. Redox regulation of glycogen biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: Analysis of the AGP and glycogen synthases. Molecular Plant. 7, 87-100 (2014).
  28. Parrott, L. M., Slater, J. H. The DNA, RNA and protein composition of the cyanobacterium Anacystis nidulans grown in light- and carbon dioxide-limited chemostats. Arch Microbiol. 127, 53-58 (1980).
  29. Hihara, Y., Kamei, A., Kanehisa, M., Kaplan, A., Ikeuchi, M. DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light. Plant Cell. 13, 793-806 (2001).

Play Video

Cite This Article
De Porcellinis, A., Frigaard, N., Sakuragi, Y. Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria. J. Vis. Exp. (125), e56068, doi:10.3791/56068 (2017).

View Video