הערכה של רקמת שומן אנושי הפונקציה Microvascular באמצעות Videomicroscopy
Summary
Videomicroscopy מערכות משמשות כדי לבחון מאפיינים פונקציונליים של רקמת שומן מבודדת רבים בתגובה לגירויים פיזיולוגיים ולא תרופתי. טכניקה זו ניתן לבחון פנוטיפים microvascular בתחומים שונים רקמת שומן בבני מהשמנת יתר.
Abstract
בעוד השמנה קשורה קשר הדוק להתפתחות מחלה מטבולית, לב וכלי דם, מעט מאוד ידוע על המנגנונים המפקחים על תהליכים אלו. זה המשוערות כי מתווכים פרו-atherogenic שוחרר רקמות שומן במיוחד בשיתוף עם השמנה מרכזית/ויסצרלית עשוי לקדם שינויים בכלי הדם פתוגניים באופן מקומי, מערכתית, הרעיון כי מחלות לב וכלי דם עשוי להיות תוצאה של חוסר תפקוד רקמת שומן ממשיכה להתפתח. כאן, אנו מתארים שיטה ייחודית של videomicroscopy זה כרוך ניתוח של תגובות מרחיב כלי דם ומצר את כלי הדם של שלם רבים אנושי קטן יוסר בתחנה אדיפוז מהנושאים אנושי חי. Videomicroscopy משמש כדי לבחון מאפיינים פונקציונליים של microvessels מבודדים בתגובה לגירויים פיזיולוגיים או תרופתי באמצעות מערכת לחוץ המחקה תנאים ויוו . הטכניקה היא גישה שימושית כדי להשיג הבנה של פתופסיולוגיה ואת המנגנונים המולקולריים שתורמים בתפקוד כלי הדם באופן מקומי בתוך חצרו רקמת שומן. יתר על כן, חריגות בתוך microvasculature רקמת שומן גם קושרו עם מחלות מערכתיות. אנחנו מוחלים בטכניקה זו כדי לבחון תגובות וסקולרית דיפו ספציפיים בנושאים מהשמנת יתר. אנחנו העריכו אנדותל תלוית vasodilation הזרימה המוגברת והן אצל רבים אדיפוז (50-350 קוטר פנימי מיקרומטר, 2-3 מ מ אורך) מבודד שני מחסני אדיפוז שונים במהלך ניתוח בריאטרי מ באותו הפרט. להדגים כי רבים מן השומן מהבטן התערוכה vasodilation אנדותל תלוית לקוי לעומת כלי מבודד בתחנה תת עורית. הממצאים מראים כי הקרביים microenvironment קשורה בתפקוד אנדותל כלי הדם אשר עשוי להיות רלוונטי תצפיות קליניות קישור מהבטן השמנה מוגברת למנגנונים מחלה מערכתית. הטכניקה videomicroscopy יכול לשמש כדי לבחון פנוטיפים כלי דם מן המחסנים שומן שונים, כמו גם משווים ממצאים בין אנשים עם דרגות שונות של השמנת יתר, חוסר תפקוד מטבולי. השיטה יכולה לשמש גם כדי לבחון תגובות כלי הדם longitudinally בתגובה התערבויות קליניות.
Introduction
Videomicroscopy היא טכניקה שימושית מנוצל כדי לבחון את תפקוד עושות קטנים רבים מן החי ניסויים ex-vivo. המעבדה שלנו התמקדה לנתח את microvessels הקטן של תאי רקמת שומן שונים כדי לאפיין את ההשפעות של אדיפוז שונים microenvironments על microvasculature. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא כי כלי הדם של הגוף האנושי להישאר פונקציונלי יכולים להיבדק בקלות בתוך דקות עד שעות בעקבות ביופסיה. מצבים פיזיולוגיים הן חיקה ויציבה transmural הלחץ נשמר בשטח intraluminal באמצעות קנולות מיקרו-זכוכית אשר מסכם את הדברים מאפיינים רבים ויוו . 1 , 2 . בנוסף, מלכודת videomicroscopy אמין עם תוכנת זיהוי קצה אוטומטית מאפשרת עבור הערכה כמותית והן איכותית של אנדותל תלוית ועצמאית – מרחיב כלי דם, מצר את כלי הדם קיבולת של בודדים כלי ב בזמן אמת, המתיר הערכת פיזיולוגיים מהירה בתגובה לגירויים פיזיים ולא תרופתי. 3 טכניקות אחרות microvascular הינם גם זמינים כגון חוט myography, אשר נוטה להיות פחות זמן רב ולמדוד את המתח התגובות אגוניסטים שונים על ידי כוח מתמר.
המעבדה שלנו הוחל videomicroscopy שבחן את הקשר בין תפקוד כלי הדם, התמקדות השפעת תחומים שונים רקמת שומן על להערכת השמנה. השמנה מרכזית עם הצטברות שומן מהבטן התוך בבטן נקשרה הקרוב ביותר adipocytokine ייצור, חילוף חומרים לקוי של הסיכון cardiometabolic. זה הניחו כי תפקוד רקמת שומן עם ייצור יתר של pro-atherogenic dysregulation ציטוקינים ו adipokine הם בחריפות מעורבים תהליכים אלה, אך מולקולות ספציפיות רגולטוריות ומטרות הטיפול נותרו במידה רבה לא ידועות. 4 . זאת ועוד, רקמת שומן מקומית ברמה rarefaction נימי, זלוף לקוי קושרו רקמת שומן pseudohypoxia ו- dysregulation מטבולית. ההשערה כי מחלות לב וכלי דם עשוי להיות התוצאה של בעיות בתפקוד רקמת שומן הוא מתפתח. מתווכים פרו-atherogenic שוחרר שומן, במיוחד בשיתוף עם מרכז/מהבטן השמנה, סביר לקדם בתפקוד אנדותל, שינויים בכלי הדם פתוגניים שניתן להתבטא באופן מקומי להערכת אדיפוז וזוהה באמצעות במסמך זה תיאר מתודולוגיה. 5
הערכה תפקודית של רקמת שומן מבודדת רבים היא גישה שימושית כדי להשיג הבנה של פתופסיולוגיה ואת המנגנונים המולקולריים שתורמים בתפקוד כלי הדם האנושי ההשמנה. לחקור מנגנונים שתורמים תפקוד ספציפי דיפו השמן, פיתחנו שיטות לבחון אנדותל תלוית ותגובות – עצמאית vasodilatory של microvasculature, ולהעריך את הביטוי רגולטוריות שונות מועמדים לזווג הקרביים ו התת-עורית (SC) רקמת שומן דגימות המתקבל הנושאים כרסתן בזמנו של ניתוח בריאטרי.
Protocol
Representative Results
Discussion
הקרע ובידוד של אדיפוז רבים מן הרקמות הסובבות יכול להיות תהליך מהגידולים ועתירת זהיר תשומת לב לכל פרט טכני פרוטוקול. ההליך microdissection דורש מוקפד מיומנויות וכלי ניתוח מיוחדים כדי למנוע נזק אפשרי של שריר חלק או אנדותל תא שכבות microvasculature. דקירות מקרית קטנה בקיר arteriolar יכול למנוע intraluminal לחץ ותוצאו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות המתנדבים בשל השתתפותם מחקרים אלה ואת הצוות הכירורגי במרכז הרפואי בבוסטון למתן ביופסיות רקמת שומן. ד ר Gokce נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) מענקים HL081587, HL114675 ו- HL126141. ד ר Farb נתמך על-ידי NIH להעניק K23 HL135394.
Materials
| Chemical Name | |||
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 223506 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
| Endothelin-1 | Sigma Aldrich | E7764 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetra acetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
| Nw-nito-L-arginine methyl ester hydrochloride | Sigma Aldrich | N5751 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium phosphate (KH2PO4) | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Papaverine | Sigma Aldrich | P3510 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3 ) | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (NaH2Po4) | Sigma Aldrich | S9638 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Forceps | Finescience tools | 15000-08 | |
| Inverted microscope | Zeiss Achromat | ||
| Laboratory tubing | Euro-Pharm | 250100306F999 | |
| Needle/pippette puller | David kopf instruments | 720 | |
| Ophthalmic monofilament nylon suture | Surgical specialties | A7756N | |
| Scissors | Finescience tools | 150000-08 | |
| Vessel Chamber | DMT | VAS v.2.1 |
References
- Schubert, R., Mulvany, M. J. The myogenic response: established facts and attractive hypotheses. Clin Sci (Lond). 96 (4), 313-326 (1999).
- Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography. J Vis Exp. (101), e50997 (2015).
- Gutterman, D. D., et al. The Human Microcirculation: Regulation of Flow and Beyond. Circ Res. 118 (1), 157-172 (2016).
- Fuster, J. J., Ouchi, N., Gokce, N., Walsh, K. Obesity-Induced Changes in Adipose Tissue Microenvironment and Their Impact on Cardiovascular Disease. Circ Res. 118 (11), 1786-1807 (2016).
- Farb, M. G., et al. Reduced adipose tissue inflammation represents an intermediate cardiometabolic phenotype in obesity. J Am Coll Cardiol. 58 (3), 232-237 (2011).
- Farb, M. G., et al. WNT5A-JNK regulation of vascular insulin resistance in human obesity. Vasc Med. 21 (6), 489-496 (2016).
- Durand, M. J., Phillips, S. A., Widlansky, M. E., Otterson, M. F., Gutterman, D. D. The vascular renin-angiotensin system contributes to blunted vasodilation induced by transient high pressure in human adipose microvessels. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307 (1), H25-H32 (2014).
- Farb, M. G., et al. Cyclooxygenase inhibition improves endothelial vasomotor dysfunction of visceral adipose arterioles in human obesity. Obesity (Silver Spring). 22 (2), 349-355 (2014).
- Park, S. Y., et al. Impact of age on the vasodilatory function of human skeletal muscle feed arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310 (2), H217-H225 (2016).
- Ives, S. J., et al. Human skeletal muscle feed arteries studied in vitro: the effect of temperature on alpha(1)-adrenergic responsiveness. Exp Physiol. 96 (9), 907-918 (2011).
- Grizelj, I., et al. Reduced flow-and acetylcholine-induced dilations in visceral compared to subcutaneous adipose arterioles in human morbid obesity. Microcirculation. 22 (1), 44-53 (2015).
- Farb, M. G., et al. Arteriolar function in visceral adipose tissue is impaired in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (2), 467-473 (2012).
- Tanner, M. J., et al. Dynamin-Related Protein 1 Mediates Low Glucose-Induced Endothelial Dysfunction in Human Arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2016).
- Ives, S. J., et al. alpha1-Adrenergic responsiveness in human skeletal muscle feed arteries: the impact of reducing extracellular pH. Exp Physiol. 98 (1), 256-267 (2013).
- Dharmashankar, K., et al. Nitric oxide synthase-dependent vasodilation of human subcutaneous arterioles correlates with noninvasive measurements of endothelial function. Am J Hypertens. 25 (5), 528-534 (2012).
- Truran, S., et al. Adipose and leptomeningeal arteriole endothelial dysfunction induced by beta-amyloid peptide: a practical human model to study Alzheimer’s disease vasculopathy. J Neurosci Methods. 235, 123-129 (2014).
- Karki, S., et al. Forkhead box O-1 modulation improves endothelial insulin resistance in human obesity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35 (6), 1498-1506 (2015).
- Shahid, M., Buys, E. S. Assessing murine resistance artery function using pressure myography. J Vis Exp. (76), (2013).
