Synaptosomal 도파민 통풍 관 및 고성능 액체 크로마토그래피 분석 대표 실험 도구 마우스에서 도파민 항상성 도파민 운송업 자의 기능과 striatal 조직에서 도파민의 수준을 평가 하 여 조사를 각각. 여기 선물이 도파민 조직 콘텐츠를 측정 하 고 도파민 운송업 자의 기능을 평가 하는 프로토콜.
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방법 논문
고성능 액체 크로마토그래피 분석 및 Synaptosomal 도파민 통풍 관의 사용에 의해 쥐에서 Dopaminergic 항상성의 평가
이 논문에서
요약
초록
도파민 (DA) 모터 활동, 보상 프로세스 및 인지 기능 modulatory 신경 전달 물질 이다. (DAergic) dopaminergic neurotransmission의 장애는 파 킨 슨 병, 주의 결핍 과잉 행동 장애, 약물 중독1,2 등 여러 중앙 신경 관련 질병에 강하게 연관 ,,34. 다 불균형과 관련 된 질병 메커니즘을 묘사 동물 모델 모방은 질병의 측면을 비판적으로 의존 이며 따라서 다 항상성의 특정 부분을 평가 하는 프로토콜 소설 통찰력 및 가능한 치료를 제공 하는 것이 중요 이 질병의 대상
여기, 선물이 두 유용한 실험 프로토콜을 결합 하는 때 쥐에 DAergic 시스템의 기능 읽기 제공. 생 화 학적 및 기능 매개 변수 다 항상성에 다 수준 및 도파민 운송업 자 (DAT) 기능5의 평가 통해 얻을 수 있습니다. 다 시스템을 조사할 때 안정적으로 성인 두뇌에서 다의 내 생 레벨을 측정 하는 능력은 필수적입니다. 따라서,에 우리가 현재 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 수행 하는 방법을 뇌 조직 검사의 수준을 결정 하는 마우스에서 우리 지가 (dStr) 및 핵 accumbens (NAc), 조직에는 실험을 수행 하지만 방법은 다른 다 innervated 뇌 영역에 대 한 적합도.
출시 검사의 시간적 및 공간적 활동 제어할 DAT 연 접 맨끝에 다의 재흡수를 위해 근본적 이다 레벨과가에서 DAT의 기능을 알면 다 항상성 평가할 때 주요 중요성의 이다. 여기, 우리는 동시에 표면 수준 및 synaptosomal6 다 이해 분석 결과 사용 하 여 함수에 대 한 정보를 추론할 수 있는 프로토콜을 제공 합니다.
표준 immunoblotting 프로토콜와 결합 하는 현재 메서드 DAergic 시스템 특성 관련 도구와 연구원을 제공 합니다.
서론
도파민 (DA) modulatory 모터 행동, 보상 및 인지 기능1,7,,89에 대 한 중요 한 신경 이다. 다 항상성 불균형 주의-결핍 과잉 행동 장애, 약물 중독, 우울증과 파 킨 슨 병1등 여러 가지 정신병 질병에 연루 된다. 다 연 접 신경에서 시 냅 스 갈라진 틈, 어디 그것에 바인딩하고 사전 및 postsynaptic 막에 수용 체를 활성화에 신호를 전달 하는 그로 인하여 더 발표입니다. 출시 후 시 냅 스에 다의 수준은 공간적으로 일시적으로 제어 DAT3,10. 전송 sequesters 세포 외 공간에서 다 하 고 따라서 생리 다 레벨3,11을 격려. 쥐에 있는 DAT의 유전 제거는 hyperdopaminergic 형 수준에 의해 상승 된 시 냅 스 다, 특징 고갈의 세포내 다 풀 심오한 postsyn....
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프로토콜
덴마크 동물 실험 검사자의 지침 (허가 번호: 2017-15-0201-01160) 그 뒤를 이었다는 로컬 동물 복지의 감독 하에 완전히 AAALAC 공인 시설에서 실험 수행 위원회.
1. synaptosomal 도파민 글귀 (방법 1)
참고:이 프로토콜 두 두뇌의 병렬 평가 하지만에서 4 개의 두뇌를 가진 synaptosomal 다 이해 실험 수행을 성공적으로 사용 될 수 있습니다 병렬.
- 준비
- 라벨 48 1.5 mL 마이크로 원심 튜브 표 1 (각 두뇌에 대 한 24) 당 합니다. 각 두뇌에 속하는 튜브에 대 한 서로 다른 색상을 사용 하 여 샘플 사이 혼란을 방지 하기 위해
- 레이블 51 섬광 관 #1-51.
- 장소 인산 염 (PBS) 얼음에 버퍼링합니다. 이 두뇌 냉장을 유지 하는 데 사용할 것입니다.
- 미리 4 쿨을 원심 분리기에 돌려 ° c.
- 미리 해야 정확한 조직 무게 (단원 2.6) synaptosomal 준비 하는 동안 두 개의 마이크로 원심 튜브 무게.
- 준비 균질 버퍼 4 mM HEPES 0.3....
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결과
현재 다 글귀 프로토콜 (그림 1) DAT의 쥐에서 synaptosomes의 기능을 평가 하는 데 필요한 모든 단계를 포함 합니다. 다 이해 방법 (그림 2)의 대표적인 데이터 조정 되지 않은 데이터 (그림 2B)와 함께 포화 곡선을 묘사 하 고 데이터 (그림 2A)을 조정. 채도 커브는 야생 타입 마우스에서 통풍 관을 보여줍니다. 일반적으로 하나의 돌연변이 마우스, 각 유전자 형5에 대 한 포화 곡선으로 이어질 것 이라고 비교를 위해 다 이해를 할 수 있습니다. 이 경우, 2A 및 2B에 야생 유형 및 돌연변이 쥐 차이 여러 요인에 의해 설명 수 있습니다. 더 철저 한 프로토콜, 원시 (2B)와 단백질 조정 (2A).......
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토론
이 원고는 선택의 어떤 마우스 모델에서 다 항상성 윤곽을 그리 다 유용한 실험 프로토콜을 설명 합니다. DAT. 통해 다 전송 기능을 평가 하기 위해 HPLC 및 synaptosomal 다 이해를 사용 하 여 쥐에서 뇌 조직에서 다의 측정 수준에 대 한 자세한 프로토콜 제공 절차, 프로토콜 및 HPLC 실험 synaptosomal 다 이해 분석 결과 대 한 제한 아래 정교 합니다.
Synaptosomal 통풍 관 프로토콜 표면 biotinylation 실험13DAT. 결합의 기능에 유용한 통찰력을 제공할 수 있습니다, 그리고 총 금액, 표면 수준 및 DAT의 기능에 대 한 지식을 얻을 수 있습니다. DAT와 다 전송에 미치는 영향 및 다양 한 질병에의 참여의 중요 한 역할을 감안할 때, 그것은 DAT 기능 모델 수 분석 실험을 설정 하는 주요 목표 되었습니다. Synaptosomal 다 이해 실험의 장점 중 하나는 그것이 수행된 게시물 .......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
이 작품은 UCPH 2016 프로그램의 우수성 (U.G., 아칸소, 대리)에 의해 지원 되었다, Lundbeck 재단 (M.R.) Lundbeck 재단 센터 Biomembranes에서 Nanomedicine (U.G.), 국립 연구소의 건강 보조금 P01 DA 12408 (U.G.), 덴마크 독립적인 연구-의료 과학 (U.G.)를 위한 위원회.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| COMT 억제제 | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | synaptosomal DA 흡수 프로토콜[ |
| 3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | synaptosomal DA 흡수 프로토콜용 |
| 유리 극세사 필터 | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | synaptosomal DA 흡수 프로토콜 |
| HiSafe 섬광 유체 | Perkin Elmer | 1200-437 | synaptosomal DA 흡수 프로토콜 |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | synaptosomal DA 흡수 프로토콜 | |
| BCA 단백질 분석 키트 | Thermo Scientific Pierce | 23225 | synaptosomal DA 흡수 프로토콜 |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | synaptosomal DA 흡수 프로토콜 |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | 시냅토솜 DA 흡수 프로토콜용 |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | 시냅토솜 DA 흡수 프로토콜 |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | 시냅토솜 DA 흡수 프로토콜 |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | 시냅토솜 DA 흡수 프로토콜 |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | 시냅토솜 DA 흡수 프로토콜의 경우 |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | 시냅토솜 DA 흡수 프로토콜 |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | 시냅토솜 DA 흡수 프로토콜 |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | 시냅토솜 DA 흡수 프로토콜 |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | 시냅토솜 DA 흡수 프로토콜 프로토콜 |
| 도파민 | 시그마 생명 과학 | H8502 | synaptosomal DA 흡수 프로토콜 |
| 코카인 | 시그마 생명 과학 | C5776 | synaptosomal DA 흡수 프로토콜 |
| 뇌 매트릭스 | ASI 기기 | RBM2000C | synaptosomal DA 흡수 프로토콜 |
| Cafano 기계식 테플론 교란기 | Buch & Holm | 단종 | 시냅토솜 DA 흡수 프로토콜 (균질화) |
| Antec Decade (암페로메트릭 검출기) | Antec, Leiden, The Netherlands | 단종: 새로운 모델 DECADE Elite / Lite™ 전기 화학 검출기 유형 175 및 176 | HPLC 프로토콜 |
| 용 Avantec 0.22 μ m 유리 필터 | Frisenette ApS, 덴마크 | 13CP020AS | HPLC 프로토콜 |
| 칼럼 : Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | 부품 번호 : 00A-3300-E0 | HPLC 프로토콜 |
| 용 LC 솔루션 소프트웨어 | Shimadzu | LabSolutions 시리즈 워크 스테이션 | HPLC 프로토콜 |
| 용 과염소산 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | HPLC 프로토콜 (조직 준비) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | HPLC 프로토콜 용 |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie& Berntsen | 1.06346 1000g | HPLC 프로토콜 용 |
| 나트륨 1- 옥탄 설포 네이트 일 수화물 | Aldrich | 74885 -10g | HPLC 프로토콜 |
| 용 Acetonitrile, 등용매 HPLC 등급 | Scharlau | AC03402500 | HPLC 프로토콜 |
| 용 Filtre 0.22um | Frisenette ApS, 덴마크 | Avantec 13CP020AS | HPLC 프로토콜 (조직 준비) |
| ortho-Phosphoric acid 85 % | 머크 | 1.00563. 1000ml | HPLC 프로토콜 |
| 전극 | Antec, Leiden, 네덜란드 | AN1161300 | HPLC 프로토콜 (온라인 설명서 참조) |
| DECADE II 전기 화학 검출기 | Antec, Leiden, 네덜란드 | Lite&trade의 검출기 프로그램; 전기화학 검출기 유형 175 및 176 | HPLC 프로토콜용 |
참고문헌
- Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
- Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and tr....
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재인쇄 및 허가
