Karakterisering van cel migratie binnen driedimensionale In Vitro wond omgevingen

Summary

Het doel van dit protocol is te evalueren van het effect van de factoren van de pro – en anti – migratory op cel migratie binnen een driedimensionale fibrine-matrix.

Abstract

Momenteel de meeste in vitro modellen van wondgenezing, zoals gevestigde kras testen, betrekken studeren cel migratie en wond sluiting op twee-dimensionale oppervlakken. De fysiologische omgeving in welke in vivo wond genezing plaatsvindt is echter driedimensionale in plaats van twee-dimensionale. Het wordt steeds duidelijker dat cel gedrag verschilt sterk in tweedimensionale vs. driedimensionale omgevingen; Daarom is er behoefte aan een meer fysiologisch relevante in vitro modellen voor het bestuderen van de cel migratie gedrag in de wond sluiting. De hierin beschreven methode zorgt voor de studie van de cel migratie in een driedimensionaal model dat beter fysiologische omstandigheden dan tevoren vastgelegde tweedimensionale kras testen weerspiegelt. Het doel van dit model is te evalueren cel uitgroei via het onderzoek van de cel migratie van een sferoïde lichaam ingebed in een matrix van fibrine in aanwezigheid van pro – of anti – migratory factoren. Met behulp van deze methode, cel uitvloeisel van het lichaam sferoïde in een drie-dimensionale matrix kan worden waargenomen en na verloop van tijd via helderveld microscopie en analyse van sferoïde lichaamszone gemakkelijk meetbaar is. Het effect van pro-trekkende en/of remmende factoren op cel migratie kan ook worden geëvalueerd in dit systeem. Deze methode biedt onderzoekers met een eenvoudige methode voor het analyseren van cel migratie in driedimensionale wond verbonden matrices in vitro, waardoor de relevantie van in vitro cel studies voorafgaand aan het gebruik van in vivo dier modellen.

Introduction

Wondgenezing is een complex proces dat leidt tot het herstel van weefsel integriteit na letsel. Dit proces is onderverdeeld in vier overlappende stadia omsloten door hemostase, ontsteking, proliferatie en remodeling, die elk geregeld zijn door een complexe combinatie van oplosbare signalen, cel-matrix interacties en cel-cel communicatie. ^{1 , 2} de orkestratie van deze signalen regelt een veelheid van cellulaire reacties in de wondgenezing en bovenal cel migratie. ^{3 , 4} cel migratie is een zeer dynamisch proces afhankelijk van zowel cellulaire fenotypes en de biochemische en biofysische eigenschappen van de extracellulaire matrix milieu. ⁵ cellen voortdurend sonde hun milieu van de extracellulaire matrix door middel van integrine-gemedieerde trajecten; Dit proces maakt cellen te voelen van een breed scala van matrix eigenschappen met inbegrip van de topografie, stijfheid en opsluiting. Tweedimensionale (2D) analyse van cel migratie blijkt dat migratie wordt gedreven door lamellipodia formatie op geavanceerde kennisgebieden door middel van de generatie van actine-filament-bundels. Latere vorming van focal verklevingen op geavanceerde kennisgebieden, in combinatie met actomyosine gedreven contractie en intrekking bij de afvallende flank, rijdt de cel uit. ⁶ de cellulaire migratie three-dimensional (3D) op dit moment niet goed wordt begrepen, recente studies tonen echter aan dat 3D migratie is beduidend anders dan de hierboven mechanisme in 2D beschreven en waarschijnlijk door alteratief mechanismen gedreven wordt. Bijvoorbeeld, recente studies door Petrie et al. aangetoond dat, afhankelijk van de eigenschappen van de ECM, cellen in 3D-matrices tussen lamellipodium en lobopodium gedreven mechanismen van migratie schakelen kunnen. ⁷ omdat cel migratie een essentieel onderdeel van de wond genezing reactie is, 3D-modellen van cel migratie zijn cruciaal voor het begrip van fysiologische reacties op verschillende stimuli tijdens de wondgenezing. Hoewel cel trekgedrag op 2D oppervlakken is aangetoond dat variëren sterk van migratie in 3D-matrices, meest recente in vitro modellen van cel migratie tijdens het genezingsproces, met inbegrip van de gevestigde kras assay, wond gebruiken 2D enkelgelaagde culturen. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14} meer onlangs ontwikkelde testen hebben een 3D matrix gebruikt, maar nog steeds cultuur cellen in een enkelgelaagde op de top van de matrix, dus de beperking van de mogelijkheid om echt recapituleren de driedimensionaliteit van de cel milieu in vivo. ¹⁵

Het doel van de hier beschreven methode is om te studeren cel migratie in een fysiologisch relevante 3D-model, in plaats van op een 2D ondergrond, om een meer robuuste inzicht van migratie reacties die zijn gekoppeld aan de toegepaste prikkels. Deze methode zorgt voor de evaluatie van cel migratie binnen een 3D fibrine clot matrix in aanwezigheid van de factoren die activeren of remmen trajecten die is gekoppeld aan cel migratie. Een matrix van fibrine werd gekozen voor deze methode als gevolg van de kritische rol van fibrine in een vroeg stadium van de wondgenezing; volgende letsel, een fibrine clot wordt gevormd binnen wond omgevingen te vloeien bloedverlies en fungeert als een steiger voor de eerste cel infiltratie tijdens weefselherstel en remodeling. ^{2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} bovendien fibrine klinisch als een chirurgische sealant wordt gebruikt en de samenstelling van de mastieken is gebonden aan cel migratie en ultimate genezing van resultaten. Een eerdere studie door Cox et al. fibroblast migratie met fibrine stolsels bestaat uit verschillende fibrine en trombine concentraties met het oog op het optimaliseren van een fibrine-sealant onderzocht. Migratie van cellen uit fibrine stolsels op kunststof gerechten werd in deze studies gekwantificeerd. ²⁰ hier presenteren we een methode waarmee de kwantificering van de migratie van de cellen binnen de 3D fibrine-omgeving. Terwijl de specifiek in dit protocol beschreven methode fibrine gebruikt, kan dit model eenvoudig worden aangepast voor het gebruik van alternatieve matrix materialen zoals gewenst, zoals collageen of andere 3D-matrices. Daarnaast presenteren wij het gebruik van de fibroblast spheroïden in deze test omdat fibroblast migratie in het bed van de wond van het allergrootste belang voor de synthese van de extracellulaire matrix en reparatie/remodelleren van weefsel is. Echter, tijdens de reparatie proces neutrofielen zijn het eerste celtype migreren naar het bed van de wond, gevolgd door macrofagen. Fibroblasten beginnen dan te infiltreren in de omgeving van de wond ongeveer 48 uur na de eerste schade, aan het begin van de proliferatieve fase van de wond genezingsproces. ¹⁹ deze test kan eenvoudig worden aangepast om op te nemen van neutrofiele granulocyten, macrofagen, of andere celtypes te evalueren hoe wijzigingen in fibrine clot structuur van invloed zijn op migratie van deze celtypes. ²¹

Ter uitvoering van deze bepaling, ten eerste, een sferoïde fibroblast gevormd met behulp van een wijziging van de technieken beschreven voor cultuur van de cel van de stam. ²² de fibroblast sferoïde wordt vervolgens omgezet in een 3D fibrine-matrix, waarna uitgroei kan worden gemakkelijk gecontroleerd en gekwantificeerd gedurende meerdere dagen. Dit protocol rekening wordt gehouden met de 3D van fysiologische systemen door inbedding 3D cel spheroïden binnen een matrix van fibrine, dus het vermijden van de beperkingen in relevantie teweeggebracht door het gebruik van een 2D groei oppervlak met een enkelgelaagde cel naar model trekgedrag, terwijl toch toe te staan voor de evaluatie van de werking van de cel in een zeer gecontroleerde in vitro -omgeving.

Protocol

1. dag 1: cel en de bereiding van het reagens Opmerking: alle cel en reagens voorbereiding dient te worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast ter voorkoming van verontreiniging van monsters. Warm gefilterd Dulbecco ' s gewijzigd Eagle ' s Medium (DMEM), foetaal runderserum (FBS), L-glutamine en penicilline/streptomycine in een waterbad 37 ° C. Voorbereiden neonatale menselijke dermale fibroblast (HDFn) media door haar aan te vullen opgewarmd DMEM met 1…

Representative Results

Sferoïde cultuur kan worden gebruikt om met succes het evalueren van het effect van pro- en anti-trekvogels agenten op fibroblast migratie in vitro3D fibroblast spheroïden kunnen worden gevormd via opknoping drop cultuur over een periode van 72 h (Figuur 1). Na de periode van de cultuur, spheroïden worden ingebed binnen de klonter matrix en beeld met behulp van helderveld microscopie (Figuur 2). Het eerste…

Discussion

Dit protocol maakt het mogelijk voor het onderzoek van de cel migratie in de wondgenezing ECMs door middel van een 3D-model in vitro verbonden . Een cruciale stap in de goede uitvoering van de procedure is de goede ontwikkeling van de fibroblast spheroïden; cel concentratie tijdens voorbereiding is geoptimaliseerd voor het geven van een beginconcentratie van 2.500 cellen/drop, waardoor spheroïden aan formulier betrouwbaar over een incubatietijd van 72 uur. Als een onvoldoende aantal cellen worden gebruikt, wor…

Materials

Materials
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine	VWR	VWRL0148-0500	DMEM already containing L-glutamine can also be used
100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic	VWR	10861-594	Dishes of any size can be used for hanging drop culture
Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested	Sigma-Aldrich	12306C-500ML
L-glutamine	Fisher Scientific	ICN1680149	Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine
Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Human Dermal Fibroblasts, neonatal	Thermo Fisher	C0045C	Can be replaced with other cell type of interest
21 G x 1 1/2' needle	BD	305167	22 G x 1 1/2 needles will also work
1 mL syringe	VWR	89174-491	Syringes of any volume can be used
Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)	VWR	82051-004
Human Fibrinogen – Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted	Enzyme Research Laboratories	FIB 3	Can be replaced with matrix protein of interest
Human Alpha Thrombin	Enzyme Research Laboratories	HT 1002a	May not be necessary depending on matrix protein of interest
Equipment
BSL2 cell culture hood
Cell culture incubator
Inverted microscope with 10X objective
Centrifuge compatibile with 15 mL tubes