नर्व-मुक्त के निर्माण और दीर्घकालिक रखरखाव<em> हाइड्रा</em
Summary
कोलेचिइसन के साथ एक डबल उपचार के माध्यम से, एक प्लांट-व्युत्पन्न विष है जो कोशिकाओं को विभाजित करता है, तंत्रिका मुक्त हाइड्रा वल्गरिस उत्पन्न किया जा सकता है। ये हाइड्रा अपने दम पर फ़ीड नहीं कर सकते हैं या नहीं कर सकते हैं। यह पत्र प्रयोगशाला में तंत्रिका मुक्त हाइड्रा वल्गरिस के दीर्घकालिक रखरखाव के लिए एक बेहतर तरीके का वर्णन करता है।
Abstract
हाइड्रा की मध्यवर्ती सेल वंश में बहुसंख्यक स्टेम कोशिकाएं शामिल हैं, और उनके डेरिवेटिव: ग्रंथि कोशिकाएं, नेमाटोसाइट्स, जर्म सेल और तंत्रिका कोशिकाएं। अंतस्परिक कोशिकाओं को लगातार दो उपचार के माध्यम से समाप्त किया जा सकता है, जो एक प्लांट-व्युत्पन्न विष है जो कि कोशिकाओं को विभाजित करता है, साथ ही दो अलग-अलग उपचारों के माध्यम से समाप्त किया जा सकता है, इस प्रकार अंतरालीय स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त विभेदित कोशिकाओं के नवीकरण की संभावना नष्ट हो जाती है। यह तंत्रिका कोशिकाओं की कमी वाले हाइड्रा की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है तंत्रिका रहित पोलीप अपने मुंह को खिलाने, आसवन, दबाव या आसमाटिक दबाव को नियंत्रित नहीं कर सकता। हालांकि, ऐसे जानवरों को जीवित रहने और प्रयोगशाला में अनिश्चित काल तक सुशोभित किया जा सकता है, यदि नियमित रूप से बलपूर्वक खिलाया जाता है और फटा हुआ होता है। तंत्रिका कोशिकाओं की कमी पशु व्यवहार और पुनर्जनन को विनियमित करने में तंत्रिका तंत्र की भूमिका के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। तंत्रिका मुक्त Hydra रखरखाव के लिए पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल में जुड़ी हुई तकनीक जैसे हाथ-खींचा माइक्रोप्रोपेट टचहाइड्रा को भोजन और साफ करने के लिए ips यहां, नर्व मुक्त हाइड्रा के रखरखाव के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल पेश किया गया है। ठीक-छेड़े संदंश का उपयोग मुंह खोलने और ताजा ढंग से मार डालने वाली आर्टेमिया को सम्मिलित करने के लिए किया जाता है। बल-खिला के बाद, जानवरों के शरीर के गुहा को सिगरंज और हाइपोडर्मिक सुई का इस्तेमाल करके ताजा माध्यम से पिघल दिया जाता है, जिसे अपरिवर्तनीय सामग्री को निकालने के लिए कहा जाता है, जिसे "बर्चिंग" कहा जाता है। संदंश और सिरिंजों के इस्तेमाल से बल-खिला और नर्व-मुक्त हाइड्रा को मारने की यह नई पद्धति हाथ-खींचा माइक्रोप्रिपेट युक्तियों का उपयोग करके मुंह-पाइपेटिंग की आवश्यकता को समाप्त करती है। इस प्रकार यह प्रक्रिया को सुरक्षित और काफी अधिक समय कुशल बनाती है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि हाइपोस्टोम में तंत्रिका कोशिकाओं का सफाया हो चुका है, एंटी-टायरोसिन-ट्यूबिलिन का उपयोग कर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का आयोजन किया जाता है।
Introduction
हाइड्रा की तंत्रिका तंत्र में एक तंत्रिका जाल होता है, जिसमें उपकला टिशू परत 1 के साथ जुड़े न्यूरॉन्स होते हैं। तंत्रिका जाल हाइपोस्टोम और पेडनीकल में घनी होती है और शरीर के स्तंभ 2 में घनी होती है। तंत्रिका कोशिकाएं अंतःस्राय स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न होती हैं, जो मल्टीपीटेंट स्टेम कोशिकाएं होती हैं जो कि स्रावी कोशिकाओं, नेमाटोसाइट्स, जर्म सेल और न्यूरॉन्स 1 को जन्म देते हैं। कोलेचिइन्सन 3 , 4 के साथ उपचार के माध्यम से हाइड्रा वल्गरिस के अंतरालीय कोशिकाओं को खत्म करना संभव है, एक पौधे से व्युत्पन्न विष है जो कोशिकाओं को विभाजित करता है। हालांकि कोलेचिइन्स को अन्य जीवों में माइक्रोट्यूबल पॉलिमराइजेशन को बाधित पाया गया है, पिछले अध्ययन में यह पता चला है कि पूरे उपचार में हाइड्रा में माइक्रोट्यूब्यूल मौजूद हैं, यह सुझाव देते हैं कि कोल्विकिसिन हाइड्रा 3 में इस तरह से कार्य नहीं करता है। एक और सेंटऔडी से पता चलता है कि कोलेचिइसन कुछ जीवों में ट्यूबिलिन को कुशलता से बाँध नहीं करता है, जिसमें थेट्रायमेन पिरैरिमिरीस , ज़िया मेस, क्लैमिडोमोनास और स्कीज़ोसाकार्मीयस पॉम शामिल हैं, जो इस अंतर की व्याख्या कर सकते हैं 5 । कोलेक्विइन उपचार में अंतःस्रावी उपकला कोशिकाओं द्वारा अंतःस्राय कोशिकाओं के phagocytosis लाया जाता है और इस प्रकार उन जानवरों के निर्माण के लिए अनुमति देता है जो तंत्रिका कोशिकाओं, ग्रंथि कोशिकाओं और निमेटोसइट्स की कमी कर रहे हैं। यह स्पष्ट नहीं है कि अंतःस्राय कोशिकाओं को कोल्विकिन उपचार के लिए अतिसंवेदनशील क्यों है। यह देखते हुए कि पोस्ट-माइटोटिक मध्यवर्ती कोशिकाएं और अंतःस्राय स्टेम सेल वंश को क्षतिग्रस्त कर दिया गया है और फागौसीटॉज किया गया है, कैंपबेल ने निष्कर्ष निकाला है कि कोलेचिइसन सीधे मैटोटिक गतिविधि को प्रभावित नहीं कर रहा था 3 । विशेषकर, कॉल्विकिन उपचार हाइड्रा वल्गरिस में अच्छी तरह से काम करता है , लेकिन अन्य प्रजातियों में भी काम नहीं करना दिखाया गया है, जैसे कि हाइड्रा ऑलिगैक्टिस 6 । </उन्हें> तंत्रिका मुक्त Hydra viridis 7 का उत्पादन करने के लिए colchicine और hydroxyurea के साथ एक संशोधित उपचार का उपयोग किया जा सकता है। तंत्रिका मुक्त हाइड्रा (जिसे कभी-कभी "उपकला हाइड्रा " 8 कहा जाता है) इसलिए ऊतक होमोस्टेसिस में मध्यवर्ती कोशिका वंश और पुनर्जन्म में इन विशेष सेल प्रकार की भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है।
हाइड्रा नर्वस सिस्टम के बिना जीवित करने में सक्षम जानवर का एकमात्र ज्ञात उदाहरण हो सकता है। तंत्रिका मुक्त हाइड्रा हाइड्रा पुनर्जनन, होमोस्टैसिस, और व्यवहार को विनियमित करने में तंत्रिका जाल की भूमिका के विदारक के लिए एक विशेष रूप से उपयोगी मॉडल के रूप में काम करता है। उदाहरण के लिए, तंत्रिका मुक्त हाइड्रा में मध्यवर्ती कोशिकाओं का परिचय ग्राफ्टिंग के माध्यम से तंत्रिका सेल भेदभाव के लक्षण वर्णन के लिए अत्यधिक क्षेत्र-विशिष्ट 9 के रूप में होता है । इसके अलावा, क्योंकि तंत्रिका मुक्त हाइड्रा पुनर्जीवित कर सकते हैं, वेवैकल्पिक, तंत्रिका तंत्र-स्वतंत्र पुनर्जनन मार्गों की जांच को सक्षम करें ऐसा ही एक उदाहरण अपिशनल न्यूरोजेनेसिस और सिर का गठन है, जो कि जंगली सूक्ष्म हाइड्रा में तंत्रिका तंत्र में cnox-2 फ़ंक्शन पर निर्भर करता है, लेकिन तंत्रिका-मुक्त हाइड्रा में अव्यावहारनीय प्रतीत होता है, यह सुझाव देता है कि वैकल्पिक प्रमुख पुनर्जनन प्रक्रिया हो सकती है 10
न्यूरोजेनेसिस 11 के नुकसान के बाद उपकला सेल अभिव्यक्ति और न्यूरोजेनिक और न्यूरोट्रांसमिशन जीन का नियमन करने के लिए नर्व-फ्री हाइड्रा का भी उपयोग किया गया है। तंत्रिका मुक्त हाइड्रा सहजता संकुचन फटने 12 को प्रदर्शित नहीं करती है, यह दर्शाता है कि इन फटने को तंत्रिका तंत्र द्वारा नियंत्रित किया जाता है। तंत्रिका मुक्त हाइड्रा , हालांकि, संदंश के साथ शरीर के कॉलम को छिड़कने के जवाब में अनुबंध करते हैं, यह सुझाव देते हैं कि मैकेनिकल उत्तेजनाओं के जवाब में संकुचन को मध्य युग्मन द्वारा मध्यस्थ किया जाता हैउपकला कोशिकाओं में एचएएच अंतर जंक्शन, जबकि स्वस्थ संकुचित व्यवहार तंत्रिका कोशिकाओं 13 में अंतर जंक्शनों के माध्यम से युग्मन द्वारा मध्यस्थता है।
नर्व-फ्री हाइड्रा भोजन या कम ग्लूटाथियोन 3 के साथ पेश किए जाने पर अपना मुंह नहीं खोलता, यह सुझाव देता है कि संवेदी न्यूरॉन्स भोजन की उपस्थिति का पता लगाने और खुले मुंह को संकेत देने के लिए आवश्यक हैं। इसके अलावा, तंत्रिका जाल आसमाटिक दबाव को समझने में एक भूमिका निभाते हैं, क्योंकि तंत्रिका रहित जानवर स्वभाव से अपने आंतरिक हाइड्रोस्टेटिक दबाव को मुंह खोलने से नियंत्रित करने में असमर्थ हैं, जिससे उनके लक्षण गुब्बारे की उपस्थिति 3 , 4 ( चित्रा 1 बी ) हो सकती है। लगातार मैन्युअल डिफ्लेशन द्वारा तंत्रिका मुक्त हाइड्रा में हाइड्रोस्टैटिक दबाव का विनियमन हाइपोस्टोम और बॉडी कॉलम में कुछ असामान्य आकारिकी का नुकसान हुआ। हालांकि, पुरानी अपस्फीति के कारण वृद्धि के साथ हस्तक्षेप हुआ, एलविचलन, उभरता हुआ, और ऊतक संगठन 8
हालांकि नसों से मुक्त हाइड्रा स्वयं को खिलाने में सक्षम नहीं हैं और इन्हें स्वयं पर बल देते हैं, इन्हें प्रयोगशाला में मैन्युअल रूप से बल-खिला कर और प्रत्येक जानवर को फेंकने से अनिश्चित काल तक बनाए रखना संभव है। पिछला प्रकाशनों ने बल-खिला और नर्व-मुक्त हाइड्रा को मारने के तरीकों का वर्णन किया है, हालांकि इन प्रोटोकॉल में सूक्ष्मदर्शी युक्तियों का उपयोग शामिल है, जिन्हें उचित आकार के साथ सावधानी से खींच लिया जाना चाहिए और साथ ही टिउइंग 14 द्वारा विंदुक से जुड़े मुखपत्र का उपयोग करना चाहिए। यहां, भोजन और बरामद करने का एक सरल, सुरक्षित, और अधिक समय-कुशल तरीका वर्णित है।
इसके अलावा, पिछले अध्ययनों में व्यक्तिगत कोशिकाओं में निश्चित जानवरों के पृथक्करण और कोशिका आकृति विज्ञान 3 , 4 , 15 की परीक्षा के माध्यम से तंत्रिका कोशिकाओं की अनुपस्थिति की जांच करना शामिल था। एचपहले, अल्फ़ा-ट्यूबिलिन के टीरोबर्टेड कार्बोक्जिल-टर्मिनस के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का प्रयोग हाइपोस्टोम 13 , 16 में न्यूरॉन्स की कमी की जांच के लिए मृदु करने के लिए एक मानार्थ तरीके के रूप में किया गया था। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि peduncle में न्यूरॉन्स भी इस एंटीबॉडी 13 का उपयोग करके देखे जा सकते हैं, हालांकि इन न्यूरॉन्स और साथ ही शरीर के कॉलम में उनको बाहर करना मुश्किल है। जबकि इम्यूनोहिस्टोकेमेस्ट्री हायोस्टोम में तंत्रिका कोशिकाओं की अनुपस्थिति की पुष्टि करने के लिए पर्याप्त है और सेल प्रकार के आकारिकी पर विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं है, इन्हें अंतरालीय स्टेम कोशिकाओं के अनुपस्थिति और इन कोशिकाओं के अन्य डेरिवेटिव्स का इस्तेमाल नहीं किया जा सकता। पृथक्करण और कोशिका आकृति विज्ञान अध्ययन अधिक कठोर हैं और इलाज के प्रत्येक चरण के बाद शेष प्रत्येक सेल प्रकार की संख्या का एक मात्रात्मक खाता दे सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हाइड्रा अंतःस्राय कोशिकाओं को एक डबल कॉल्विकिन उपचार 3 , 4 के माध्यम से समाप्त किया जा सकता है। पहले उपचार के बाद के दिनों में, हाइड्रा के संलयन से विकृत हाइड्रा में संलयन…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने सिरिंज और सुई तकनीक को अनुकूल बनाने और सुश्री डेनिएल हागस्ट्रॉम और डॉ। रोब स्टील के लिए मदद के लिए तंत्रिका मुक्त जानवरों को बनाने और बनाए रखने के मूल प्रोटोकॉल के बारे में चर्चा के लिए डॉ। डिक कैंपबेल (यूसी इरविन) का धन्यवाद किया है। (यूसी इरविन) पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए। यह काम आरसीएसए और एनएसएफ अनुदान सीएमएमआई -1447272 द्वारा समर्थित था।
Materials
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 ml Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X – 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 ml Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
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