Generatie en langdurig onderhoud van zenuwvrije<em> Hydra</em
Summary
Door een dubbele behandeling met colchicine kan een plantaardige toxine die delende cellen doodt, zenuwvrije Hydra vulgaris gegenereerd worden. Deze Hydra kunnen niet op zichzelf voeden of opkomen. Dit artikel beschrijft een verbeterde methode voor langdurig onderhoud van zenuwvrije Hydra vulgaris in het laboratorium.
Abstract
De interstitiële cellijn van Hydra omvat multipotente stamcellen, en hun derivaten: kliercellen, nematocyten, kiemcellen en zenuwcellen. De interstitiële cellen kunnen worden geëlimineerd door twee opeenvolgende behandelingen met colchicine, een plantaardig afgeleid toxine dat delende cellen doodt, waardoor het potentieel voor vernieuwing van de gedifferentieerde cellen die afgeleid zijn van de interstitiale stamcellen wissen. Dit zorgt voor de generatie van Hydra die zenuwcellen ontbreekt. Een zenuwvrije poliep kan zijn mond niet openen om osmotische druk te voeden, te bevestigen of te reguleren. Dergelijke dieren kunnen echter overleven en onbeperkt in het laboratorium worden gekweekt als ze regelmatig worden gevoed en geborsteld. Het gebrek aan zenuwcellen zorgt voor studies van de rol van het zenuwstelsel bij het reguleren van diergedrag en regeneratie. Voorheen gepubliceerde protocollen voor zenuwvrij Hydra onderhoud behoren verouderde technieken zoals mondpipetten met handgetrokken micropipette tIps om de Hydra te voeden en te reinigen. Hier wordt een verbeterd protocol voor het onderhoud van zenuwvrije Hydra geïntroduceerd. Met fijngespoten tangen worden de mond opengemaakt en vers gedood Artemia . Na de krachtvoeding wordt de lichaamsholte van het dier gespoeld met vers medium met behulp van een spuit en een inktnek om ongeversteld materiaal te verwijderen, hierna aangeduid als "boren". Deze nieuwe methode van krachtvoeding en borstende zenuwvrije Hydra door het gebruik van tang en spuiten elimineert de behoefte aan mondpipettering met handgetrokken micropipette tips. Het maakt het proces dus veiliger en aanzienlijk meer tijd efficiënt. Om ervoor te zorgen dat de zenuwcellen in het hypostome zijn geëlimineerd, wordt immunohistochemie gebruikt met anti-tyrosine-tubuline.
Introduction
Het zenuwstelsel van Hydra bestaat uit een zenuwnet, met neuronen geassocieerd met beide epitheliale weefsellagen 1 . Het zenuwnet is dikker in de hypostome en de peduncle en minder dicht in de lichaamskolom 2 . De zenuwcellen zijn afkomstig van interstitiële stamcellen, die multipotente stamcellen zijn die aanleiding geven tot secretory cellen, nematocyten, kiemcellen en neuronen 1 . Het is mogelijk om de interstitiële cellen van Hydra vulgaris te elimineren door middel van behandeling met colchicine 3 , 4 , een plantaardig afgeleid toxine dat delende cellen doodt. Hoewel colchicine gevonden is om microtubulepolymerisatie in andere organismen te remmen, heeft een eerder onderzoek aangetoond dat microtubules aanwezig zijn in Hydra gedurende de gehele behandeling, wat suggereert dat colchicine op deze manier niet in Hydra 3 optreedt. Een andere stUty suggereert dat colchicine niet efficiënt bindt aan tubuline in sommige organismen, waaronder Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas en Schizosaccharomyces pombe, die dit verschil kunnen verklaren 5 . De colchicinebehandeling induceert fagocytose van de interstitiële cellen door de endodermale epitheelcellen 3 en maakt derhalve het mogelijk creatie van dieren die zenuwcellen, kliercellen en nematocyten ontbreken. Het is onduidelijk waarom de interstitiële cellen bijzonder vatbaar zijn voor colchicinebehandeling. Gezien het feit dat zowel postmittotische interstitiële cellen als de interstitiale stamcelstammen beschadigd en fagocytose zijn, concludeerde Campbell dat colchicine geen directe invloed heeft op de mitotische activiteit 3 . In het bijzonder werkt de colchicine behandeling goed in Hydra vulgaris, maar is aangetoond dat het ook niet werkt bij andere soorten, zoals Hydra oligactis 6 . </Em> Een gewijzigde behandeling met colchicine en hydroxyurea kan gebruikt worden om zenuwvrije Hydra viridis 7 te produceren. Zenuwvrije Hydra (ook soms aangeduid als "epithelial Hydra " 8 ) zijn daarom een nuttig hulpmiddel om de rollen van deze gespecialiseerde celsoorten uit de interstitiale cellijn in de homeostase van weefsels en regeneratie te bestuderen.
Hydra kan het enige bekende voorbeeld zijn van een dier dat in staat is om zonder een zenuwstelsel te leven. Zenuwvrije Hydra dienen als een bijzonder nuttig model voor het dissecteren van de rol van het zenuwnet bij het regelen van hydra regeneratie, homeostase en gedrag. Bijvoorbeeld, de introductie van interstitiële cellen in zenuwvrije Hydra via transplantatie liet de karakterisering van zenuwceldifferentiatie toe als zeer regio-specifiek 9 . Bovendien, omdat zenuwvrije Hydra kan regenereren, zijHet onderzoek mogelijk maken van alternatieve, zenuwstelsel onafhankelijke regeneratie pathways. Een dergelijk voorbeeld is apische neurogenese en hoofdvorming , die blijkt te zijn afhankelijk van de cnox-2 functie in het zenuwstelsel in wildtype Hydra , maar lijkt onmogelijk te zijn in zenuwvrije Hydra , wat suggereert dat er een alternatief hoofdregeneratieproces kan zijn 10 .
Zenuwvrije Hydra zijn ook gebruikt om epitheliale celuitdrukking en regulatie van neurogene en neurotransmissiegenen na het verlies van neurogenese 11 te bestuderen. Zenuwvrije Hydra vertoont geen spontane samentrekkingen 12 , wat aangeeft dat deze barsten door het zenuwstelsel gereguleerd worden. Zenuwvrije Hydra treedt echter overeen als reactie op het klemmen van de lichaamskolom met pincet, wat suggereert dat samentrekking in reactie op mechanische stimuli gemedieerd wordt door koppeling throuGh gap junctions in epitheelcellen, terwijl spontane contractiele gedrag wordt gemedieerd door koppeling door middel van gapingen in zenuwcellen 13 .
Zenuwvrije Hydra openen hun mond niet wanneer ze worden aangeboden met voedsel of gereduceerd glutathion 3 , wat suggereert dat sensorische neuronen nodig zijn om de aanwezigheid van voedsel op te sporen en de mond te openen om te openen. Bovendien lijkt het zenuwnetje een rol te spelen bij het detecteren van osmotische druk, omdat zenuwvrije dieren hun inwendige hydrostatische druk niet automatisch kunnen reguleren door mondopening, waardoor hun karakteristieke ballonachtige uitstraling 3 , 4 ( Figuur 1B ) wordt veroorzaakt. Regeling van de hydrostatische druk in zenuwvrije Hydra door frequente manuele deflatie leidde tot verlies van enige abnormale morfologie in de hypostoom en lichaamskolom. Chronische deflatie leidde echter tot inmenging met de groei, elOngelijkheid, ontluikende en weefselorganisatie 8 .
Hoewel zenuwvrije Hydra niet in staat zijn zich te voeden en op zichzelf te voeden, is het mogelijk om ze onbepaald in het laboratorium te handhaven door elk dier handmatig te voeden en te begraven. Vorige publicaties hebben methoden beschreven voor krachtvoeding en borstende zenuwvrije Hydra , maar deze protocollen hebben betrekking op het gebruik van micropipette tips die handig moeten worden getrokken, naar de juiste grootte, evenals het gebruik van een mondstuk dat via de buis 14 is verbonden met de pipet. Hier wordt een eenvoudiger, veiliger en meer tijd-efficiënte methode om te voeden en te boren beschreven.
Daarnaast betroffen vroegere studies de afwezigheid van zenuwcellen door dissociatie van vaste dieren in individuele cellen en onderzoek van celmorfologie 3 , 4 , 15 . HImmunohistochemie met een monoklonaal antilichaam tegen de getande carboxyterminal van alfa-tubuline werd gebruikt als een gratis methode voor maceratie om te controleren op de uitputting van neuronen in de hypostome 13 , 16 . Vorige studies hebben aangetoond dat neuronen in de peduncle ook kunnen worden visualiseerd met behulp van dit antilichaam 13 , maar deze neuronen evenals die in de lichaamskolom zijn moeilijker te maken. Terwijl immunohistochemie voldoende is om de afwezigheid van zenuwcellen in het hypostome te bevestigen en geen deskundigheid nodig heeft op celtype morfologie, kan het niet worden gebruikt om te controleren of er geen interstitiële stamcellen en de andere derivaten van deze cellen zijn. Dissociatie- en celmorfologie studies zijn strengere en kunnen een kwantitatief overzicht geven van de cijfers van elk celtype die na elke fase van de behandeling overblijven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hydra interstitiële cellen kunnen worden geëlimineerd via een dubbele colchicine behandeling 3 , 4 . In de dagen na de eerste behandeling is het van cruciaal belang om contact tussen individuele Hydra te vermijden om fusie van Hydra- stukken in vervormde Hydra te vermijden. Ook kunnen dieren die ongeassistreerd zijn na de eerste behandeling verwijderd worden, omdat de tweede colchicinebehandeling wellicht niet voldoende is o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Dick Campbell (UC Irvine) voor discussies over het oorspronkelijke protocol voor het opwekken en onderhouden van zenuwvrije dieren, mevrouw Rui Wang voor hulp bij het aanpassen van de spuit- en naaldtechniek, en mevrouw Danielle Hagstrom en dr. Rob Steele (UC Irvine) voor opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de RCSA en NSF-subsidie CMMI-1463572.
Materials
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 ml Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X – 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 ml Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
- Bode, H. R. The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution. J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).
- Hager, G., David, C. N. Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migration. Development. 124, 569-576 (1997).
- Campbell, R. D. Elimination of Hydra interstitial and nerve cells by means of colchicine. J. Cell. Sci. 21, 1-13 (1976).
- Marcum, B. A., Campbell, R. D. Development of Hydra lacking nerve and interstitial cells. J. Cell. Sci. 29, 17-33 (1978).
- Burns, R. G. 3H-colchicine binding: Failure to detect any binding to soluble proteins from various lower organisms. Exp. Cell. Res. 81, 285-292 (1973).
- Lee, H. -. T., Campbell, R. D. Development and Behavior of an Intergeneric Chimera of Hydra (Pelmatohydra oligactis Interstitial Cells Hydra attenuata Epithelial Cells). Biol. Bull. 157 (2), 288-296 (1979).
- Novak, P. Preparing Hydra viridis with Nerve Cells and No Interstitial Cells, or with Neither of These Cell Types. Hydra: Research Methods. , 295-297 (1983).
- Wanek, N., Marcum, B. A., Lee, H. -. T., Chow, M., Campbell, R. D. Effect of hydrostatic pressure on morphogenesis in nerve-free Hydra. J. Exp. Zool. 211, 275-280 (1980).
- Minobe, S., Koizumi, O., Sugiyama, T. Nerve cell differentiation in nerve-free tissue of epithelial Hydra from precursor cells introduced by grafting. Dev. Biol. 172 (1), 170-181 (1995).
- Miljkovic-Licina, M., Chera, S., Ghila, L., Galliot, B. Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis. Development. 134 (6), 1191-1201 (2007).
- Wenger, Y., Buzgariu, W., Galliot, B. Loss of neurogenesis in Hydra leads to compensatory regulation of neurogenic and neurotransmission genes in epithelial cells. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (20150040), (2015).
- Campbell, R. D., Josephson, R. K., Schwab, W. E., Rushforth, N. B. Excitability of nerve-free Hydra. Nature. 262, 388-390 (1976).
- Takaku, Y., Hwang, J. S., et al. Innexin gap junctions in nerve cells coordinate spontaneous contractile behavior in Hydra polyps. Sci. Rep. 4 (3573), (2014).
- Marcum, B. A. Culturing Epithelial Hydra. Hydra: Research Methods. , 287-290 (1983).
- David, C. N. A quantitative method for maceration of Hydra tissue. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 171, 259-268 (1973).
- Gröger, H., Schmid, V. Larval development in Cnidaria: A connection to Bilateria. Genesis. 29 (3), 110-114 (2001).
- Lenhoff, H. M. Water, Culture Solutions, and Buffers. Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).
- Shenk, M. A., Bode, H. R., Steele, R. E. Expression of Cnox-2, a HOM/HOX homeobox gene in hydra, is correlated with axial pattern formation. Development. 117, 657-667 (1993).
- Böttger, A., et al. Horizontal Gene Transfer Contributed to the Evolution of Extracellular Surface Structures: The Freshwater Polyp Hydra Is Covered by a Complex Fibrous Cuticle Containing Glycosaminoglycans and Proteins of the PPOD and SWT (Sweet Tooth) Families. PLoS One. 7 (12), (2012).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev. Biol. 13 (8), (2013).
