Bewertung der vaskulären Kontrollmechanismen Nutzung Videomikroskopie der isolierten Widerstand Arterien von Ratten
Summary
Dieses Manuskript beschreibt in Vitro Videomikroskopie Protokolle für die Bewertung der Gefäßfunktion in Ratte zerebralen Widerstand Arterien. Das Manuskript beschreibt auch Techniken für die Bewertung der kapilläre Dichte mit Gewebekulturen beschrifteten Lektine und Gewebe Perfusion mit Laser-Doppler-Flowmetry.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von in-vitro- Fernsehen Mikroskopie auszuwertende Gefäßfunktion in isolierte zerebrale Widerstand Arterien (und andere Schiffe) und beschreibt Techniken für die Bewertung der Gewebedurchblutung mit Laser Doppler Flowmetry (LDF ) und kapilläre Dichte Nutzung Eindringmittel beschriftet Griffonia Simplicifolia (GS1) Lektin. Aktuelle Methoden zur Untersuchung isoliert Widerstand Arterien an Transmural Druck begegnet in Vivo und in Ermangelung von parenchymatösen Zelle Einflüsse stellen ein wichtiges Bindeglied zwischen in-Vivo -Studien und Erkenntnissen aus molekularen reduktionistische Ansätze, die begrenzten in integrative Antworten auf die ganze Ebene Einblick. LDF und Techniken, um selektiv Arteriolen und Kapillaren mit Gewebekulturen beschriftet GS1 Lektin identifizieren bieten praktische Lösungen für Ermittler, die Erkenntnisse aus Studien der isolierten Widerstand Arterien erweitern können. Dieses Whitepaper beschreibt die Anwendung dieser Techniken, grundlegende Kenntnisse der vaskulären Physiologie und Pathologie in der Ratte als allgemeines experimentelles Modell zu gewinnen, und in einer Vielzahl von spezialisierten gentechnisch verändert “Designer” Ratte-Stämme, die bieten kann wichtige Erkenntnisse über den Einfluss bestimmter Gene auf wichtige vaskulären Phänotypen. Nutzen diese wertvolle experimentelle Ansätze in der Ratte Stämme durch selektive Zuchtstrategien und neue Technologien für die Herstellung von gen-Knockout-Modelle bei der Ratte entwickelt dehnt die strenge der wissenschaftlicher Räumlichkeiten in Knockout-Maus-Modellen entwickelt und Dieses Wissen zu mehr relevanten Tiermodell, mit einem gut verständlichen physiologischen Hintergrund und Eignung für physiologische Untersuchungen aufgrund seiner Größe zu erweitern.
Introduction
Die frühesten Studien der Gefäßfunktion in Arterien verwendet Conduit Arterien und in vielen Fällen die Aorta. Krafterzeugung in großen Arterien wurde in der Regel untersucht, durch das Anbringen eines Ring-Segments der Arterie zu einem Kraftaufnehmer in einem Gewebe-Bad; bei der Aorta Streifen durch Schneiden spiralförmige des Schiffes, so dass der glatten Muskelfasern in Längsrichtung zwischen den Punkt der Anlage und der Kraftaufnehmer, zu den besten Schätzwert für die Kraft, die durch Kontraktion der orientiert waren die glatte Muskulatur entlang seiner Längsachse. Die Standardtechnik für das Schneiden von spiralförmigen Streifen der Hauptschlagadern war, legen Sie einen Glasstab in das Lumen des Gefäßes, machen Sie einen Schnitt in der Gefäßwand im gewünschten Winkel und halten bis zum Ende der exponierte Kante der Gefäßwand, wie der Schnitt verlängert wurde, um ein Ganzes zu produzieren spiralförmigen Streifen des Schiffes. Zu diesem Zeitpunkt die endotheliale Seite des Schiffes war in der Regel ausgelöscht, um Ablagerungen zu entfernen, vor Befestigung des Schiff-Streifens zu Kraftaufnehmers und Eintauchen der Vorbereitung in Sauerstoff und Temperatur gesteuert Gewebe Bad. Schließlich, dass Ansatz zu einem der bekanntesten und wichtigsten Entdeckungen in der Geschichte der Physiologie von Furchgott und Zawadski1, nämlich die Rolle des Endothels führte abgeleitet entspannende Faktor (EFRE), anschließend identifiziert als Stickstoffmonoxid, in Regulierung der Gefäßfunktion. Das entscheidende Ereignis zu dieser Entdeckung war eine Situation, in der die Ermittler eine intakte Endothel durch Vermeidung des Kontakts der endothelialen Seite der Arterie mit ausländischen Oberflächen beibehalten, und bemerkte, dass der Aorta Streifen nicht die erwarteten aufweisen, Kontraktion von Acetylcholin (ACh), aber stattdessen entspannt als Reaktion auf ACh. Basierend auf dieser Beobachtung, die Ermittler entwickelt eine “Sandwich”-Vorbereitung, in der sie eine Aorten-Segment mit einem intakten Endothel (aber nicht in der Lage, Kontraktionskraft zu generieren) angebracht, zu einem standard spiralförmigen Streifen der Aorta und konvertiert die ACh-induzierte Kontraktion in eine Entspannung.
Zwei bedeutende Fortschritte auf diesem Gebiet, das heute weitgehend benutzt werden sind die Entwicklung von Präparaten Messen aktiv Kontraktionskraft in kleinen Widerstand Arterien2,3 (z. B. im Darm Mesenterium3 ) und kanülierte Widerstand Arterie Vorbereitungen4,5,6. In einer der frühesten Berichte, Mulvany und Halpern3 beschriebenen Verwendung der Draht Myograph Zubereitung, aktive Kontraktionskraft in isolierten Widerstand Arterien aus dem Darm Mesenterium spontan Hypertensive Ratten (SHR) zu studieren und normotonen WKY Kontrollen. Im Anschluss an die Entwicklung des Systems der Draht Myograph waren kanülierte Widerstand Arterie Präparate entwickelt, um Studien der Schiffe näher, die in Vivo Bedingungen4,5,6zu ermöglichen. Während beide Ansätze wertvolle Ergebnisse zu liefern, hat die kanülierte Arterie Vorbereitung die zusätzlichen Vorteile von mehr effektiv Erhaltung intrinsische aktiv Ton in den Arterien; und so die Ermittler, aktive myogen Reaktionen auf Veränderungen im Transmural Druck und Schiff Reaktionen auf Veränderungen in der Durchflussmenge und endotheliale Schubspannung zu studieren (siehe Beitrag von Halpern und Kelley6).
Ein wesentliches Ziel der vorliegenden Arbeit soll beschreiben, wie die altehrwürdige Technik der Videomikroskopie mit isolierten, kanülierte Widerstand Arterien um genaue Informationen über die Mechanismen zu gewinnen, die aktiv Ton in dieser entscheidenden Regeln beschäftigen Schiffe, unabhängig von Einflüssen der neuronalen, humorale oder parenchymatösen Zelle. Diese Basisinformationen, mit einem standard Rattenmodell und Beispiele aus unseren Studien von neu genetisch engineered Ratte Stämme, vermitteln dem Leser eine Vorstellung von den Arten der Erkenntnisse bezüglich Gefäßfunktion, die mit dem Fernsehen gewonnen werden können Mikroskopie-Ansätze und die eingesetzt werden können, in Studien mit jeder Kontrolle und experimentelle Gruppe(n) der Ermittler zu wählen, darunter mächtige neue experimentelle Ratte Modelle produziert durch gezielte Inzucht und neu entwickelte genetische Engineering-Techniken.
Dank der Präzision des Fernsehens Mikroskopie Ansätze bieten Messung von Durchmesserwechsel kanülierte Arterie Vorbereitungen sehr wertvolle Informationen über Endothel-abhängigen und Endothel-unabhängige Mechanismen der vaskulären Entspannung, als auch wichtige (und manchmal unerwartete) Veränderungen der vaskulären Kontrollmechanismen, die mit Bluthochdruck, hohe salzarme Kost und andere experimentellen Interventionen. Darüber hinaus Messung von Druck-Durchmesser Beziehungen in isoliert und kanülierte Widerstand Arterien, die durch die Behandlung mit Ca2 +maximal entspannt sind-freie Lösung oder eine pharmakologische gefäßerweiternde Medikament, ermöglicht es den Prüfer bewerten strukturelle Veränderungen in den Arterien durch vaskuläre remodeling und passive Spannungs-Dehnungs-Beziehungen-7 zu berechnen, die wichtige Erkenntnisse Änderungen in die passive mechanische Eigenschaften der Arterien bieten kann, die arterielle Funktion beeinflussen können unabhängig von (oder zusätzlich zu) ändert sich der aktive Kontrollmechanismen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass Erkenntnisse aus Studien der isolierten Widerstand Arterien durch Informationen, die Verwendung von LDF, eine praktische Methode für die Bewertung der Gewebedurchblutung an das ganze Tier Level8,9 ergänzt werden können ,10, und durch kapilläre Dichte mit Gewebekulturen gekennzeichneten GS1 Lektin Bewertung gewonnenen Informationen, die spezifisch bindet an Glykoprotein Moieties in der Basalmembran der kleinen Arteriolen und Kapillaren11 , 12. letztere Methode ermöglicht eine sehr genaue Schätzung kapilläre Dichte, die nicht die klassische Schwierigkeiten bei der Abschätzung der kapilläre Dichte durch Schiffe in Vivo, z. B. fehlende nicht durchblutet zählen unterliegt Schiffe, wo die Durchblutung durch aktive Schließung der Arteriolen gestoppt ist. Wenn Sie zusammen verwendet, bieten diese Ansätze wichtige Erkenntnisse zum funktionelle Veränderungen in isolierten Widerstand Arterien zu Veränderungen der Gewebedurchblutung Ebene der mikrozirkulatorischen korrelieren; und einige Beispiele für die Verwendung dieser wertvolle Ansätze in Verbindung mit kanülierte Arterie Techniken erhalten Sie auch in der vorliegenden Handschrift.
Der vorliegende Beitrag konzentriert sich auf die Verwendung von Techniken der Videomikroskopie, vaskuläre Veränderungen in den Arterien von fremd-Sprague-Dawley Ratten zu bewerten. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese Techniken sehr wertvoll in Aufklärung phänotypische Veränderungen in hochspezialisierten gentechnisch Ratte Stämme erstellt durch selektive Züchtung oder gen Bearbeitung mit Hilfe von Techniken bewährt haben. In diesem Manuskript stellen wir Beispiele dafür, wie video Mikroskopiertechniken wichtige Informationen bezüglich Gefäßfunktion in einer Reihe von wertvollen Rat zur Verfügung gestellt haben-Modelle, darunter die Dahl Salz-Sensitive (SS) Ratte-eine Inzucht Ratte Belastung, die die am weitesten verbreitete ist experimentelles Modell verwendet untersuchen die Mechanismen von Salz sensible Hypertenson18,19,20,21,22,23; und Consomic Ratten durch selektive Züchtung von SS Ratten mit dem Salz-unempfindliche braun Norwegen (BN) Ratte Stamm erstellt. Jedes Chromosom aus Braun Norwegen Ratte wurde in der Consomic-Ratte-Panels Introgressed einzeln in den Dahl SS24,25,26 genetischen Hintergrund. Verwendung von Consomic Ratte Platten lieferte wertvolle Hinweise auf bestimmten Chromosomen, die Salz Empfindlichkeit der Blutdruck und anderen Phänotypen, darunter vaskuläre Reaktivität24,25,26 beitragen ,27,28.
Selektive Zuchtstrategien nutzen SS Ratten und Consomic Ratten tragen einzelne BN Chromosomen konnten auch die Generation der verengten Congenic Stämme mit kleinen Segmenten der einzelnen braun Norwegen Chromosomen Introgressed in die genetische Dahl-SS Hintergrund22,29. Diese können extrem wertvollen input auf bestimmte Gene oder schmale Regionen der Chromosomen, die entscheidende physiologischen Variablen, z. B. Blutdruck, Nierenschädigung und vaskuläre Reaktivität22,29beeinflussen können. Eine weitere leistungsstarke Ergänzung zu der Ratte genetische Toolbox ist die Entwicklung von Ratte gen Knockout Modelle nutzen fortschrittliche gen Bearbeitung Techniken einschließlich ZFN, transcriptional Aktivator-artigen-Effektor Nukleasen (TALENS), und zuletzt CRISPR-Cas913 ,14,15,16,17. Das Aufkommen dieser mächtigen Techniken, mit denen Gene bei der Ratte geschlagen werden können ist eine immens wichtige Entwicklung, weil gen Knockout Studien bisher verwendet haben (und weiterhin verwenden) Mäuse fast ausschließlich. Eine weitere experimentelle Komponente in der vorliegenden Arbeit zeigt die Bedeutung von kanülierte Arterie Techniken und Videomikroskopie, physiologische Kontrollmechanismen bei Knockout Ratten fehlt die master Antioxidans und Zelle schützende Transkription zu bewerten Faktor, nukleare Faktor (2 erythroiden abgeleitet) – wie – 2 (NRF2)30,31, die mit TALEN Technologie in Sprague-Dawley genetischen Hintergrund17entwickelt wurden. In-vitro- Videomikroskopie Techniken wurden in diesen Experimenten Verlust des Gens NRF2 funktionale nachzuweisen und einen potentiell wertvollen therapeutischen Ansatz basierend auf direkte Hochregulation von NRF2-vermittelten Antioxidans zu testen verwendet. Abwehrkräfte. NRF-2 ist der erhebliche therapeutische Bedeutung Bekämpfung vaskulären oxidativen Stress in den Menschen angesichts der enttäuschenden Ergebnisse der klinischen Studien mit direkten Verwaltung von Antioxidantien wie Vitamine C und E32.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wie in der Einleitung erwähnt, dieses Paper beschreibt die Verwendung von Fernsehen Mikroskopie und isolierten Widerstand Arterie Ansätze zur Bewertung der Gefäßfunktion nicht nur in standard Ratte-Modellen (wie im Video), aber auch in hochspezialisierten genetisch veränderter Ratte Stämme, die zeigen, das neuartige und leistungsfähige Einsichten, die unter Verwendung dieser Ansätze gewonnen werden können. Die Verwendung dieser leistungsfähigen Techniken, aktive Ton zu bewerten und passiv mechanischen Eigenscha…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren äußern ihren aufrichtigen Dank Katie Fink und Lynn Dondlinger für ihre unschätzbare Hilfe bei der Vorbereitung dieser Handschrift.
Zuschuss: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; und #R01-HL128242.
Materials
| SS Rat | Medical College of Wisconsin | SS/JHsd/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| SS.5BN Consomic Rat | Medical College of Wisconsin | SS-Chr 5BN/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| SS.13BN Consomic Rat | Medical College of Wisconsin | SS-Chr 13BN/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Ren1-BN Congenic Rat | Medical College of Wisconsin | SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Ren1-SSA Congenic Rat | Medical College of Wisconsin | SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Ren1-SSB Congenic Rat | Medical College of Wisconsin | SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates | Medical College of Wisconsin | SD-Nfe212em1Mcwi strain | Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu) |
| Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A | Dyets, Inc. | 113755 | |
| High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A | Dyets, Inc. | 113756 | |
| Colorado Video Caliper | Colorado Video, Inc. | Model 308 | |
| Video Camera | Hitachi | KPM1AN | |
| Microscope | Olympus Life Science | CKX41 | |
| Television Monitor | Panasonic | WVBM1410 | |
| Pressure Transducers | Stoelting | 56360 | |
| Blood Pressure Display Unit | Stoelting | 50115 | |
| Cannulated Artery Chamber | Living Systems Instrumentation | CH-1 | Single vessel chamber for general use |
| Temperature Controller for Single Chamber | Living Systems Instrumentation | TC-09S | |
| Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight | Living Systems Instrumentation | GD-MS | Provides aeration in the vessel bath |
| Gas Exchange Oxygenator, Miniature | Living Systems Instrumentation | OX | Allows gas exchange with perfusate |
| Laser-Doppler Flowmeter | Perimed | PeriFlux 5000 LDPM | |
| GS1 Lectin | Vector Labs | RL-1102 | |
| Glass Capillary Tubes for Micropipettes | Fredrich Haer Co. | 27-33-1 | 2 mm ODX1 mm ID |
| Verticle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 700C | |
| Nylon suture material (10/0)-3 PLY | Ashaway Line and Twine Manufacturing Co. | 114-ANM-10 | Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Vannas Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Protandim | Protandim | NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU) | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-212 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Chemical | S233-3 | |
| Dextrose (d-glucose) anhydrous | Fisher Chemical | D16-500 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O) | Sigma Aldrich | M1880-500 G | |
| Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O) | Sigma | C5080-500G | |
| Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4) | Sigma | S0751-500G | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Chemical | P217-500G | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | ED255-500G |
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