निष्क्रिय स्पष्टता-साफ़ माउस अंडाशय के संवहनी वास्तुकला के तीन आयामी पुनर्निर्माण
Summary
यहाँ हम बरकरार माउस अंडाशय में डिम्बग्रंथि vasculature और तोंसिल्लितिस केशिकाओं के दृश्य के लिए निष्क्रिय स्पष्टता और 3 डी पुनर्निर्माण विधि का एक अनुकूलन प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
अंडाशय मादा प्रजनन प्रणाली का मुख्य अंग है और महिला gametes के उत्पादन के लिए और अंत: स्रावी प्रणाली को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक है, लेकिन जटिल संरचनात्मक संबंधों और तीन आयामी (3 डी) के vasculature आर्किटेक्चर अंडाशय अच्छी तरह से वर्णित नहीं हैं । आदेश में 3 डी कनेक्शन और बरकरार अंडाशय में रक्त वाहिकाओं के वास्तुकला कल्पना करने के लिए, पहला महत्वपूर्ण कदम अंडाशय ऑप्टिकली स्पष्ट करने के लिए है । आदेश में ऊतक संकोचन से बचने के लिए, हम hydrogel निर्धारण आधारित निष्क्रिय स्पष्टता का इस्तेमाल किया (स्पष्ट लिपिड-विमर्श Acrylamide-संकर कठोर इमेजिंग/Immunostaining/में सीटू-संकरण-संगत ऊतक hydrogel) प्रोटोकॉल विधि एक बरकरार अंडाशय साफ करने के लिए . Immunostaining, उंनत multiphoton फोकल माइक्रोस्कोपी, और 3 डी छवि पुनर्निर्माण तो डिंबग्रंथि वाहिकाओं और तोंसिल्लितिस केशिकाओं के दृश्य के लिए इस्तेमाल किया गया । इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, हम एक महत्वपूर्ण सकारात्मक सहसंबंध (पी < 0.01) की तोंसिल्लितिस और फुफ्फुसीय दीवार की मात्रा की लंबाई के बीच दिखाया ।
Introduction
कूप अंडाशय के मौलिक संरचनात्मक और कार्यात्मक इकाई है, और इसके विकास अत्यधिक अंडाशय के भीतर vasculature से संबंधित है । रक्त वाहिकाओं के रोम के लिए पोषण और हार्मोन की आपूर्ति और इस तरह विकास और रोम के परिपक्वता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं1.
चयनात्मक रक्त वाहिका मार्करों, ट्रांसजेनिक माउस मॉडल, और दवा विकास सहित प्रौद्योगिकियों का एक संयोजन, डिंबग्रंथि संवहनी नेटवर्क, angiogenesis के बारे में हमारे ज्ञान में वृद्धि हुई है, और में रक्त वाहिकाओं के समारोह folliculogenesis । अंडाशय एक सक्रिय अंग के रूप में जाना जाता है क्योंकि यह folliculogenesis और ovulation के दौरान विभिन्न ऊतकों और संवहनी नेटवर्क को फिर से तैयार । आकार और जहाजों की संरचना में ऐसे सक्रिय remodeling के विकास और रोम की भर्ती के जैविक समारोह के लिए आवश्यक है ।
डिम्बग्रंथि वर्गों और रक्त वाहिकाओं के immunolabeling का उपयोग पारंपरिक ऊतकीय और histomorphometric तरीकों दो आयामी (2d) छवियों को2तक ही सीमित हैं । तीन आयामी (3 डी) पुनर्निर्माण प्रौद्योगिकियों के विकास के साथ, ऊतक स्लाइस के 2d छवियों एक 3d संरचना बनाने के लिए छा जा सकता है, लेकिन इस विधि अभी भी कुछ सीमाएं है-ऊतक के अनुभाग microstructures नष्ट कर सकते हैं, के कुछ भागों ऊतक अक्सर याद कर रहे हैं, और महत्वपूर्ण परिश्रम स्लाइस से प्राप्त छवियों से 3 डी पुनर्निर्माण बनाने में शामिल है । फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ पूरे ऊतक 3 डी इमेजिंग इन सीमाओं के कई दूर कर सकते हैं, लेकिन इन तरीकों भ्रूण अंडाशय में angiogenesis के मूल्यांकन के लिए सीमित कर रहे हैं3. इस तरह की स्पष्टता के रूप में पूरे ऊतक समाशोधन विधियों का प्रयोग4 visualized मात्रा में वृद्धि इतनी के रूप में प्रसव और वयस्क अंडाशय में इन समस्याओं को हल करने के लिए कर सकते हैं, और इस तरह के तरीकों किसी भी संरचनात्मक विकृति के बिना अंडाशय के ऑप्टिकल निकासी प्रदान करते हैं । बरकरार अंडाशय के 3 डी वास्तुकला की इमेजिंग छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर, इस काम में इस्तेमाल किया Imaris सॉफ्टवेयर पैकेज के रूप में के लिए एक सटीक छवि डेटाबेस प्रदान करता है ।
एक गतिशील शारीरिक प्रणाली का हिस्सा है, और यह अंडाशय के angiogenesis के विनियमन में जांच के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बनाता है… इसके अलावा, ऐसे पॉलीसिस्टिक अंडाशय सिंड्रोम या डिंबग्रंथि के कैंसर के रूप में मादा प्रजनन प्रणाली के रोग की स्थिति में डिंबग्रंथि रक्त वाहिकाओं की भूमिका का मूल्यांकन पूरे डिंबग्रंथि ऊतक इमेजिंग के माध्यम से अध्ययन किया जा सकता है । निष्क्रिय स्पष्टता विधि और उंनत छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के उपयोग के विकास के रोम के रूप में रक्त वाहिकाओं और डिम्बग्रंथि संरचनाओं के बीच संबंधों पर विस्तृत स्थानिक जानकारी प्रदान की है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान अध्ययन में, हम केशिकाओं और व्यक्तिगत बढ़ते रोम के बीच संबंधों का मूल्यांकन करने के लिए 3 डी इमेजिंग प्रस्तुत करते हैं । हमारे पिछले एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग कर काम में 9, हम बड़े vasculature की भ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन के लिए चीनी विशेष कोष से Postdocs के लिए अनुदान का समर्थन किया गया था (no 2014T70392 yf), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (no. ८१६७३७६६ से yf), नई शिक्षक भड़काना कोष, फुदन विश्वविद्यालय के Zuoxue फाउंडेशन, और विकास शंघाई पीक विषयों की परियोजना-एकीकृत चिकित्सा (२०१५०४०७) ।
Materials
| Acrylamide | Vetec | v900845 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845 |
| Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11039 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039 |
| Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11012 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| Bisacrylamide | Amresco | 172 | http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx |
| Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) | Ted Pella | 14032 | http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818 |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 10020318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318 |
| FocusClear | Celexplorer | FC-102 | http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 |
| Parafilm | Bemis | PM996 | http://www.parafilm.com/products |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 |
| PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) | Abcam | ab28364 | http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318 |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718 |
| Sodium dodecyl sulfate | Sinopharm Chemical Reagent | 30166428 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928 |
| Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) | Abcam | ab76442 | http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html |
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