Ricostruzione tridimensionale dell'architettura vascolare dell'ovaia passiva sdoganate per la chiarezza del Mouse
Summary
Qui presentiamo un adattamento del passivo chiarezza e metodo di ricostruzione 3D per la visualizzazione del vasculature ovarico e capillari follicolari nelle ovaie intatte del mouse.
Abstract
L’ovaio è il principale organo dell’apparato riproduttivo femminile ed è essenziale per la produzione di gameti femminili e per il controllo del sistema endocrino, ma le complesse relazioni strutturali e le architetture di sistema vascolare (3D) tridimensionale della ovaia non sono ben descritti. Per visualizzare le connessioni 3D e architettura dei vasi sanguigni nell’ovaia intatta, il primo importante passo è di rendere l’ovaia otticamente chiaro. Per evitare il restringimento del tessuto, abbiamo usato l’idrogel basati su fissazione passiva chiarezza (chiaro del lipido-scambiati rigida di acrilamide-ibridato idrogel tessuto Imaging / Immunostaining/In situ ibridazione-compatibile) metodo per cancellare un’ovaia intatta di protocollo . Immunostaining, microscopia confocale multifotonica avanzata e immagine-ricostruzioni 3D poi sono stati utilizzati per la visualizzazione dei vasi ovarici e capillari follicolari. Utilizzando questo approccio, abbiamo mostrato una correlazione positiva significativa (P < 0,01) tra la lunghezza dei capillari follicolari e volume della parete follicolare.
Introduction
Il follicolo è l’unità fondamentale strutturale e funzionale dell’ovaia, e suo sviluppo è altamente relativo al sistema vascolare all’interno dell’ovaio. Vasi sanguigni fornire nutrizione e ormoni ai follicoli e quindi svolgono un ruolo importante nella crescita e maturazione dei follicoli1.
Una combinazione di tecnologie, tra cui marcatori selettivi del vaso sanguigno, modelli murini transgenici e sviluppo farmaceutico, hanno aumentato la nostra conoscenza sulle reti vascolari ovarici, l’angiogenesi e la funzione dei vasi sanguigni nei follicologenesi. L’ovario è conosciuto come un organo attivo perché rimodella vari tessuti e reti vascolari durante la follicologenesi e dell’ovulazione. Tale rimodellamento attivo con le dimensioni e la struttura dei vasi è richiesto per la funzione biologica di sviluppo e reclutamento follicoli.
Tradizionali metodi istologici ed istomorfometrici utilizzando sezioni ovarici e immunolabeling dei vasi sanguigni sono limitati a immagini bidimensionali (2D)2. Con lo sviluppo di tecnologie di ricostruzione tridimensionale (3D), immagini 2D delle fette del tessuto possono essere sovrapposta per rendere una struttura 3D, ma questo metodo ha ancora alcune limitazioni — sezionamento del tessuto può distruggere le microstrutture, alcune parti della tessuto spesso mancano, e significativo lavoro è coinvolto nella fabbricazione di ricostruzioni 3D da immagini ottenute dalle fette. Intero-tessuto imaging 3D con microscopia confocale possono superare molte di queste limitazioni, ma questi metodi sono limitati alla valutazione dell’angiogenesi in ovaia embrionali3. Usando il tessuto intero metodi come chiarezza4 di compensazione può aumentare il volume visualizzato in modo da risolvere questi problemi in ovaie postnatale e adulte, e tali metodi forniscono spazio ottico dell’ovaia senza deformazioni strutturali. Imaging dell’architettura 3D dell’ovaia intatta fornisce un database di immagini precise per software di analisi di immagine, ad esempio il pacchetto di software di Imaris utilizzato in questo lavoro.
Rimodellamento dell’ovaia durante l’età adulta è parte di un sistema dinamico di fisiologico, e questo rende l’ovaia un eccellente modello per indagini nel regolamento dell’angiogenesi. Inoltre, valutare il ruolo dei vasi sanguigni ovarici in condizioni patologiche del sistema riproduttivo femminile come sindrome dell’ovaio policistico o cancri ovarici può essere studiato attraverso formazione immagine del tessuto ovarico intero. Lo sviluppo del metodo chiarezza passivo e l’uso del software di analisi avanzata delle immagini hanno fornito dettagliate informazioni spaziali sui rapporti tra vasi sanguigni e strutture ovariche come follicoli.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nello studio corrente, presentiamo 3D imaging per valutare le relazioni fra capillari e singoli follicoli crescente. Nel nostro lavoro precedente utilizzando il protocollo stesso 9, abbiamo studiato i ruoli di grande sistema vascolare, interazioni tra follicoli piliferi e la posizione dei follicoli nelle ovaie intatte del mouse. L’approccio passivo di chiarezza ci ha permesso di studiare le interrelazioni tra i corpi lutei e follicoli anche di ricostruire l’architettura ovarico a diversi stadi di …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del fondo speciale cinese per Assegnisti (n. 2014T70392 a YF), Natural Science Foundation della Cina nazionale (n. 81673766 a YF), il nuovo fondo di Priming insegnante, la Fondazione di Zuoxue dell’Università di Fudan e lo sviluppo Progetto di Shanghai picco discipline-Integrative Medicine (20150407).
Materials
| Acrylamide | Vetec | v900845 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845 |
| Alexa Flour 488 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11039 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039 |
| Alexa Flour 594 (Dilution 1:50) | Life Technologies | A11012 | https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012 |
| Bisacrylamide | Amresco | 172 | http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx |
| Black wall glass bottom dish (Willco-Dish) | Ted Pella | 14032 | http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10004818 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818 |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 12H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 10020318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318 |
| FocusClear | Celexplorer | FC-102 | http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1 |
| Parafilm | Bemis | PM996 | http://www.parafilm.com/products |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618 |
| PECAM1/CD31, platelet-endothelial cell adhesion molecule 1 (Dilution 1:10) | Abcam | ab28364 | http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html |
| Photoinitiator VA044 | Wako | va-044/225-02111 | http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US |
| Sodium chloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318 |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 2H2O) | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718 |
| Sodium dodecyl sulfate | Sinopharm Chemical Reagent | 30166428 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718 |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent | 30188928 | http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928 |
| Tyrosine hydroxylase (TH, Dilution 1:50) | Abcam | ab76442 | http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html |
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