एक ई. कोलाईआधारित कोशिका-मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली में संक्रामक Bacteriophages का संश्लेषण
Summary
सेल की एक नई पीढ़ी के मुक्त प्रतिलेखन-अनुवाद प्लेटफार्मों के लिए जीन सर्किट के निष्पादन के माध्यम से इन विट्रो में जैव रासायनिक प्रणालियों के निर्माण के लिए इंजीनियर किया गया है । इस अनुच्छेद में, हम वर्णन कैसे bacteriophages, जैसे MS2, φχ १७४, और T7, उनके जीनोम से एक सभी ई. कोलाई सेल मुक्त TXTL प्रणाली का उपयोग कर संश्लेषित कर रहे हैं ।
Abstract
सेल की एक नई पीढ़ी-मुक्त प्रतिलेखन-अनुवाद (TXTL) सिस्टम, एक अधिक बहुमुखी प्रतिभा और मॉड्यूलरता है इंजीनियर, उपंयास क्षमताओं को प्रदान करने के लिए परीक्षण ट्यूब प्रतिक्रियाओं में बुनियादी और एप्लाइड विज्ञान प्रदर्शन । पिछले एक दशक से अधिक, सेल मुक्त TXTL उपंयास multidisciplinary अनुसंधान मात्रात्मक और सिंथेटिक जीव विज्ञान से संबंधित क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक शक्तिशाली तकनीक बन गया है । नए TXTL प्लेटफार्मों विशेष रूप से सिंथेटिक या प्राकृतिक जीन सर्किट के निष्पादन के माध्यम से जैव रासायनिक प्रणालियों का निर्माण और पूछताछ के लिए उपयोगी होते हैं । इन विट्रो TXTL तेजी से प्रोटोटाइप विनियामक तत्वों और जैविक नेटवर्क के रूप में अच्छी तरह के रूप में दोहराऊंगा आणविक स्वयं विधानसभा तंत्र रहने में पाया प्रणाली को सुविधाजनक साबित कर दिया है । इस अनुच्छेद में, हम वर्णन कैसे संक्रामक bacteriophages, जैसे MS2 (आरएनए), φχ १७४ (ssDNA), और T7 (dsDNA), पूरी तरह से एक पॉट प्रतिक्रियाओं में अपने जीनोम से एक सभी ई कोलाई, सेल मुक्त TXTL प्रणाली का उपयोग कर संश्लेषित कर रहे हैं । तीन coliphages के संश्लेषण पट्टिका परख का उपयोग मात्रा है । हम बताते है कि कैसे संश्लेषित फेज की उपज प्रतिक्रियाओं की जैव रासायनिक सेटिंग्स पर निर्भर करता है । आणविक भीड़, ८००० खूंटी के एक नियंत्रित एकाग्रता के माध्यम से नकल की, परिमाण के आदेश द्वारा संश्लेषित phages की मात्रा को प्रभावित करता है । हम यह भी वर्णन कैसे phages को बढ़ाना और कैसे उनके जीनोम शुद्ध करने के लिए । प्रोटोकॉल और इस काम में प्रस्तुत परिणामों का सेट ब्याज की सेल मुक्त सिंथेटिक जीवविज्ञान और जैव इंजीनियरिंग में शामिल multidisciplinary शोधकर्ताओं के लिए होना चाहिए ।
Introduction
पिछले एक दशक से अधिक, सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रौद्योगिकी आपात multidisciplinary अनुसंधान सिंथेटिक और मात्रात्मक जीव विज्ञान से संबंधित क्षेत्रों में उपंयास अनुप्रयोगों के पते पर इंजीनियर किया गया है । मूल रूप से एक जीवित जीव से स्वतंत्र प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया, नए सेल मुक्त TXTL सिस्टम दोनों बुनियादी और एप्लाइड साइंसेज के लिए विकसित किया गया है1,2, इस प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में काफी विस्तार । TXTL प्लेटफार्मों की नई पीढ़ी के लिए उपयोगकर्ता के अनुकूल हो डिजाइन किया गया है, और अधिक कुशल (2 मिलीग्राम/एमएल के बैच मोड में प्रोटीन संश्लेषण की3), अधिक प्रतिलेखन के स्तर पर बहुमुखी4, और मॉड्यूलर इतनी के रूप में आसानी से एकीकृत उपंयास प्राकृतिक या सिंथेटिक कार्य है कि मौजूदा जैविक प्रणालियों की क्षमताओं का विस्तार5,6। विशेष रूप से, सेल मुक्त TXTL प्रणालियों आनुवंशिक कार्यक्रमों की तेजी से प्रोटोटाइप जैसे विनियामक तत्वों या छोटे आनुवंशिक सर्किट के लिए काम हो गया है7,8,9, डिजाइन को कम करने से-निर्माण-परीक्षण कुछ दिनों के लिए साइकिल । उल्लेखनीय है, नए TXTL प्रणालियों भी इस तरह के पूर्ण संश्लेषण के रूप में बड़े डीएनए कार्यक्रमों के प्रसंस्करण के लिए सक्षम हैं coliphages10,11, मजबूत पर्याप्त प्रदर्शन का प्रदर्शन करने के लिए सक्रिय जीनोमिक के पुनर्गठन का समर्थन डीएनए में रहने वाले संस्थाओं इनकोडिंग ।
TXTL प्रणालियों पारंपरिक इन विट्रो रचनात्मक जैव रासायनिक परख की तुलना में कई तकनीकी लाभ मौजूद । सेल मुक्त TXTL एक कम और खुले वातावरण में अंतिम उत्पाद के लिए जीन अभिव्यक्ति की प्रक्रिया से लिंक, के रूप में एक जीवित कोशिका के परिसर कोशिका का विरोध किया । TXTL डीएनए का उपयोग करता है इन विट्रो मेंजैव रासायनिक प्रणालियों को फिर से संगठित करना, जो आधुनिक डीएनए विधानसभा तकनीकों के साथ, दुराराध्य प्रोटीन शुद्धिकरण कदम की आवश्यकता नहीं के अलावा सस्ती और तेजी से है । सेल मुक्त अभिव्यक्ति जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं में घटकों के अधिकांश के लिए सीधी पहुंच प्रदान करता है, इस प्रकार आणविक बातचीत12के एक गहरे विच्छेदन की अनुमति । एक TXTL प्रतिक्रिया में, एक जैव रासायनिक और होगा, जो एक जीवित कोशिका में लगभग असंभव है पर भौतिक सेटिंग्स बदल सकते हैं । इन फायदों और हाल ही में सुधार को देखते हुए, TXTL प्रौद्योगिकी सिंथेटिक और मात्रात्मक जीव विज्ञान के लिए एक वैकल्पिक मंच के रूप में अधिक से अधिक लोकप्रिय होता जा रहा है । जबकि अनुसंधान समुदाय TXTL का उपयोग तेजी से बढ़ रहा है और TXTL इंजीनियरिंग में एक मानक प्रौद्योगिकी होता जा रहा है, यह समझने के लिए कैसे ऐसे प्लेटफार्मों का उपयोग करने के लिए इतना के रूप में TXTL प्रतिक्रियाओं के निष्पादन से संबंधित पर्याप्त प्रथाओं को विकसित करने के लिए आवश्यक है और परिणामों की व्याख्या ।
इस आलेख में, हम इस तरह के MS2 (आरएनए, ३.४ केबी), φχ १७४ (ssDNA, ५.४ केबी), और T7 (dsDNA, ४० केबी) के रूप में अपने जीनोम11से bacteriophages, एक पॉट प्रतिक्रियाओं में, एक सभी ई. कोलाई TXTL प्रणाली का उपयोग करने के लिए कैसे का वर्णन । हम कैसे प्रतिक्रियाओं (मैग्नीशियम और पोटेशियम सांद्रता) के जैव रासायनिक सेटिंग्स में से कुछ के संबंध में phages संश्लेषित परिवर्तन की राशि दिखा । आणविक भीड़, खूंटी ८००० सांद्रता की एक श्रृंखला के माध्यम से नकल की, परिमाण के कई आदेशों पर फेज संश्लेषण पर एक नाटकीय प्रभाव पड़ता है । एक परीक्षण ट्यूब प्रतिक्रियाओं में इस तरह के बड़े जैव रासायनिक प्रणालियों की प्राप्ति कि दोहराऊंगा समवर्ती प्रतिलेखन की प्रक्रियाओं, अनुवाद, और स्वयं विधानसभा, बुनियादी जीव विज्ञान और जैव भौतिकी से संबंधित सवालों को संबोधित करने के लिए दिलचस्प है 10 (जीन विनियमन, स्वयं विधानसभा), के रूप में अच्छी तरह के रूप में अनुप्रयोगों के विकास के लिए, जैसे repurposing फेज कार्यों के लिए नए nanostructures13का निर्माण । TXTL पर एक व्यावहारिक के अलावा, हम फेज प्रवर्धन, जीनोम निष्कर्षण और शुद्धि के लिए तरीके प्रदान करते हैं, और फेज ठहराव पट्टिका परख द्वारा । इस पांडुलिपि में प्रस्तुत तरीकों शोधकर्ताओं के लिए उपयुक्त है जो ई. कोलाई निकालने आधारित सेल मुक्त प्रणाली का उपयोग करें और bacteriophages में रुचि रखते हैं ।
इस काम में प्रस्तुत प्रोटोकॉल का पालन के रूप में संक्षेप किया जा सकता है: 1) फेज प्रवर्धन (दिन 1: टीका कोशिकाओं को तैयार, दिन 2: एकल पट्टिका, एकाधिक फेज वृद्धि, और एकाग्रता, और 3 दिवस: फेज का शुद्धि), 2) डबल-कतरा जीनोम डीएनए निष्कर्षण (phenol/क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण), और 3) सेल मुक्त फेज प्रतिक्रिया और titer प्रयोग (दिन 1: प्लेट मेजबान कोशिकाओं और आगार प्लेटें बनाने के लिए, दिन 2: सेल मुक्त प्रतिक्रिया और मेजबान सेल पूर्व संस्कृति, और दिन 3: मेजबान सेल संस्कृति और फेज titer) ।
Protocol
नोट: निम्नलिखित प्रवर्धन चरणों और निष्कर्षण विधि कई दोहरे-असहाय डीएनए फेज, जैसे, भोजी T7, enterobacteria फेज टी-4, या enterobacteria फेज & #955; (एल) के लिए काफी हद तक सामांयीकरण कर रहे हैं । वे मुख्य रूप से एक फेज जिसका जीनोम व…
Representative Results
Discussion
चेन में तकनीक के बाद, एट अल. 14 SPMC के लिए, superinfection के लिए उचित शर्तों का निर्धारण करते समय एक महत्वपूर्ण कदम पहुंच जाता है । पैरामीटर है कि सबसे निकट से एक मेजबान है तनाव superinfection को झेलने की क्षमता को ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस सामग्री के कार्यालय द्वारा समर्थित काम पर आधारित है नौसेना अनुसंधान पुरस्कार संख्या N00014-13-1-0074 (to एन), मानव फ्रंटियर विज्ञान कार्यक्रम अनुदान संख्या RGP0037/2015 (to एन), और Binational विज्ञान फाउंडेशन अनुदान २०१४४०० (to एन) ।
Materials
| Ultracentrifugation tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| Conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Gradient maker | BioComp Gradient Master | see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9. | |
| Syringe and Blunt Cannula | Monoject | 8881513918 and 888202017 | |
| Wide-bore pipette tips | Fischerbrand | 02-707-134 | |
| Plaque counter | New Brunswik Scientific | Colony Counter Model C-110 | |
| Culture tubes | Fischerbrand | 14-961-33 | |
| Cell-free system | Mycroarray Inc | Mytxtl | |
| BioComp Gradient Master | BioComp Instruments | Model 105ME | |
| LB agar plate recipe | 25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller – Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company – product number 214010). |
References
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol Adv. , (2011).
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metab Eng. , (2011).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/mL of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).
- Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system. Biotechnol Bioeng. , (2015).
- Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, (2014).
- Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12672-12677 (2003).
- Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for Rapid Prototyping of Synthetic Biological Circuits in an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free System. Acs Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
- Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. , (2015).
- Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
- Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth Biol. , (2016).
- Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system. Phys Rev Lett. 106 (4), 048104 (2011).
- Daube, S. S., Arad, T., Bar-Ziv, R. Cell-free co-synthesis of protein nanoassemblies: tubes, rings, and doughnuts. Nano Lett. 7 (3), 638-641 (2007).
- Chen, X., et al. An immunoblot assay reveals that bacteriophage T4 thymidylate synthase and dihydrofolate reductase are not virion proteins. J Virol. 69 (4), 2119-2125 (1995).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762 (2013).
- Shin, J. N. V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. J Biol Eng. , (2010).
- Caschera, F., Noireaux, V. Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems. Biotechniques. 58 (1), 40-43 (2015).
- Minton, A. P. How can biochemical reactions within cells differ from those in test tubes. J Cell Sci. 119, 2863-2869 (2006).
- Minton, A. P. Implications of macromolecular crowding for protein assembly. Curr Opin Struct Biol. 10 (1), 34-39 (2000).
- Zimmerman, S. B., Minton, A. P. Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 22, 27-65 (1993).
