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Bioengineering

Sintesi dei batteriofagi infettive in un e. coli -basato sistema di espressione senza cellula

Published: August 17, 2017 doi: 10.3791/56144
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1School of Physics and Astronomy, University of Minnesota, 2Department of Diagnostic and Biological Sciences and Institute for Molecular Virology, University of Minnesota

Summary

Una nuova generazione di piattaforme senza cellula trascrizione-traduzione è stata progettata per costruire sistemi biochimici in vitro mediante l'esecuzione di circuiti di gene. In questo articolo, descriviamo come batteriofagi, quali MS2, ΦΧ174 e T7, sono sintetizzati dal loro genoma utilizzando un sistema di TXTL senza cellula e. coli .

Abstract

Una nuova generazione di sistemi senza cellula trascrizione-traduzione (TXTL), progettato per avere una maggiore versatilità e modularità, fornire nuove funzionalità per eseguire delle scienze di base ed applicate in provetta reazioni. Nell'ultimo decennio, senza cellula TXTL è diventata una tecnica potente per un'ampia gamma di biologia related to quantitativa e sintetiche aree di ricerca multidisciplinare romanzo. Le nuove piattaforme TXTL sono particolarmente utili per costruire e interrogare i sistemi biochimici mediante l'esecuzione di circuiti gene sintetico o naturale. In vitro TXTL ha dimostrato conveniente rapidamente elementi regolatori prototipo e reti biologiche anche per quanto riguarda Riepilogo molecolare autoassemblaggio meccanismi trovano nei sistemi viventi. In questo articolo, descriviamo come infettivi batteriofagi, quali MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA) e T7 (dsDNA), interamente sono sintetizzati dal loro genoma in reazioni di uno-pentola usando un tutti Escherichia coli, sistema senza cellula TXTL. Sintesi dei tre fagi sono quantificato utilizzando il saggio della placca. Vi mostriamo come la resa del fago sintetizzato dipende dalle impostazioni delle reazioni biochimiche. Affollamento molecolare, emulato attraverso una controllata concentrazione di PEG 8000, influisce sulla quantità di fagi sintetizzati da ordini di grandezza. Inoltre descriviamo come amplificare i fagi e purificare i loro genomi. L'insieme di protocolli e risultati presentati in questo lavoro dovrebbe essere di interesse per i ricercatori multidisciplinari coinvolti in Bioingegneria e biologia sintetica senza cellula.

Introduction

Nell'ultimo decennio, la tecnologia di espressione senza cellula è stata studiata per applicazioni innovative di indirizzo in biologia relativa sintetica e quantitativa di aree di ricerca multidisciplinare emergente. Originariamente utilizzato per esprimere proteine indipendenti di un organismo vivente, nuovi sistemi senza cellula di TXTL sono stati sviluppati per entrambi Scienze di base e applicata1,2, ampliando notevolmente il campo di questa tecnologia. La nuova generazione di piattaforme TXTL è stata progettata per essere facile da usare, più efficiente (raggiungendo 2 mg/mL di sintesi proteica in batch mode3), più versatile a livello di trascrizione4e modulare in modo da integrare facilmente romanzo naturale o funzioni sintetiche che ampliano le funzionalità esistenti sistemi biologici5,6. In particolare, sistemi TXTL senza cellula sono diventati comodo per la prototipazione rapida di programmi genetici, quali elementi regolatori o piccoli circuiti genetici7,8,9, riducendo la progettazione-costruzione-prova ciclo per un paio di giorni. Notevolmente, i nuovi sistemi TXTL sono anche in grado di elaborare programmi di grandi dimensioni del DNA come la sintesi completa di fagi10,11, dimostrando forte abbastanza prestazioni per supportare la ricostituzione dell'attivo genomica DNA codificato entità viventi.

TXTL sistemi presentano molti vantaggi rispetto ai tradizionali in vitro costruttiva analisi biochimiche. Senza cellula TXTL collega il processo di espressione genica al prodotto finale in un ambiente aperto e ridotto, in contrasto con il complesso citoplasma di una cellula vivente. TXTL utilizza il DNA per ricostruire sistemi biochimici in vitro, che, con moderne tecniche di assemblaggio di DNA, è conveniente e veloce oltre a non richiedere fasi di purificazione della proteina fastidiosa. Espressione senza cellula fornisce accesso diretto alla maggior parte dei componenti nelle reazioni biochimiche, permettendo così una dissezione più profonda delle interazioni molecolari12. In una reazione di TXTL, uno può cambiare le impostazioni biochimiche e biofisiche a volontà, che è quasi impossibile in una cellula vivente. Dato questi vantaggi e miglioramenti recenti, la tecnologia TXTL sta diventando sempre più popolare come una piattaforma alternativa per la biologia sintetica e quantitativa. Mentre la comunità di ricerca utilizzando TXTL è in rapida crescita e TXTL sta diventando una tecnologia standard in Bioingegneria, è essenziale comprendere come utilizzare tali piattaforme al fine di sviluppare adeguate pratiche relazionate all'esecuzione delle reazioni di TXTL e alla interpretazione dei risultati.

In questo articolo, descriviamo come utilizzare un sistema TXTL di e. coli tutto per sintetizzare, nelle reazioni di uno-pentola, batteriofagi dal loro genoma11, quali MS2 (RNA, 3,4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5,4 kb) e T7 (dsDNA, 40 kb). Vi mostriamo come la quantità di fagi sintetizzata cambiamenti per quanto riguarda alcune delle impostazioni biochimiche delle reazioni (concentrazioni di magnesio e potassio). Affollamento molecolare, emulato attraverso una gamma di PEG 8000 concentrazioni, ha un effetto drammatico sulla sintesi dei fagi parecchi ordini di grandezza. La realizzazione di questi grandi sistemi biochimici nelle reazioni di singola provetta che ricapitolano contemporaneamente i processi di trascrizione, traduzione e auto-assemblaggio, sono interessante per affrontare questioni fondamentali legate alla biologia e biofisica 10 (regolazione genica, self-assembly), come pure per lo sviluppo di applicazioni, ad esempio di riuso funzioni dei fagi per costruire nuove nanostrutture13. Oltre a un pratico su TXTL, sono disponibili metodi per l'amplificazione dei fagi, genoma estrazione e purificazione e quantificazione dei fagi dall'analisi della placca. I metodi presentati in questo manoscritto sono appropriati per i ricercatori che utilizzano sistemi senza cellula basata l'Estratto di e. coli e sono interessati a batteriofagi.

I protocolli presentati in questo lavoro si possono riassumere come segue: amplificazione 1) dei fagi (giorno 1: preparare l'inoculazione cellule, giorno 2: singola placca, più crescita dei fagi e concentrazione e 3 ° giorno: purificazione del fago), 2) estrazione di DNA Double-stranded del genoma (estrazione del fenolo/cloroformio) e 3) senza cellula reazione dei fagi e titolo esperimento (giorno 1: piastra di cellule dell'ospite e rendere le piastre di agar, giorno 2: reazione senza cellula e host cella pre-cultura e il giorno 3: titolo di cultura e dei fagi cellula ospite).

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Protocol

Nota: la seguente procedura di amplificazione e il metodo di estrazione sono in gran parte generalizzabile per molti dei fagi del DNA double-stranded, ad es., fago T7, Fago T4 di enterobatteri o enterobatteri fago λ (L). Sono usati principalmente per un fago cui genoma non è prontamente disponibile per l'acquisto da fonti commerciali.

1. amplificazione dei fagi

Nota: la tecnica di produzione dei fagi (SPMC) singolo-placca, multi-ciclo è ben descritta per il Fago T4 in Chen, et al. 14 il seguente amplificazione dei fagi e DNA metodo di estrazione è una generalizzazione per l'utilizzo con fagi del DNA a doppio filamento e. coli, per esempio, T7, T4 o L. Il successo finale del protocollo dipende pesantemente il ceppo di cella host selezionato ' s la capacità di resistere a condizioni di superinfezione. Se le cellule dell'ospite sono instabili nell'ambito di superinfezione, o superinfezione non viene mai raggiunto, e Lisi non viene mai raggiunto durante questa fase critica, è meglio procedere con un protocollo di lisi confluente. Ciò include che separa i detriti cellulari attraverso centrifugazione ad alta velocità e dei fagi cubettatura alle velocità di ultracentrifugazione. Tutte le seguenti condizioni e parametri vanno intesi come un punto di partenza generale. Le condizioni ottimali per una linea cellulare di host locale potrebbero essere diverse; stabilire e rispettare le condizioni appropriate.

  1. Preparare cellule inoculazione
    1. inoculare 10ml media di Luria-Bertani (LB) in una provetta di cultura da 15 mL con cellule dell'ospite e. coli, per esempio, B o K12.
    2. Posto in uno shaker impostato su 250 giri/min e 37 ° C. lasciare durante la notte a crescere fino a saturazione.
  2. Single-placca, multi-ciclo dei fagi crescita e concentrazione
    1. per preparare un piatto delle placche dei fagi competente, caldo diverse piastre di LB-agar a 37 ° C per 1 h, o durante la notte.
    2. Preparare diluizioni diverse di stock dei fagi (ad es., T7, T4 o L) di concentrazione nota media LB, mirando per 2 -10 ~ 10 3 fago/mL.
    3. Aggiungere 100 µ l del pernottamento crescita concentrato delle cellule dell'ospite per ogni piastra.
    4. Scegli volumi del preparato diluizioni dei fagi corrispondente a un intervallo da 10-100 dei fagi/piastra. Aggiungere il volume richiesto di diluizioni dei fagi per ogni piatto (ad esempio, 100 µ l di 10 3 fago/mL; questo dovrebbe produrre placche ~ 100). Incubare le piastre a 37 ° C e iniziare un timer a conteggio progressivo (+ 0 h). Incubare per 4-5 h.
    5. Preparare supporti 49ml LB in un pallone da 250 mL e posto in agitatore rotativo impostato su 250 giri/min e 37 ° C.
    6. A + 2,5 h, diluire le cellule 50x aggiungendo 1 mL di coltura cellulare saturata dalla crescita durante la notte in un matraccio da pre-riscaldato contenente mezzo 49ml LB. Una volta che le cellule raggiungono registro crescita (+ 4-5h), assorbanza a 600 nm (OD 600). Determinare la concentrazione di cellule usando la conversione OD 600 di 1.0 = 8 x 10 8 cellule/mL.
    7. Diluire a 2 x 10 7 cellule/mL utilizzando ulteriori mezzi di sviluppo LB. Rimuovere la piastra di agar contenente le placche dei fagi dall'incubatrice. Utilizzare immediatamente alla fine di una pipetta Pasteur sterile per core e rimuovere una singola piastra. Soffiare la placca nelle cellule diluite e incubare a 37 ° C per 2 h (+ 6-7 h).
    8. Test per l'infezione completo prendendo un 500 µ l di campione in una provetta da 1,5 mL, aggiungendo 10 µ l cloroformio (CHCL 3) ed immediatamente Vortex ad alta velocità. Osservare se la soluzione ha chiarito. Una volta che le cellule sono completamente infetto, incubare per un altro 2 h (+ 8-9 h).
      Nota: Se le celle sono completamente infettate, essi saranno rapidamente lisare (< 2 min) e chiarire la soluzione. Altri risultati sono considerati nella discussione sezione qui sotto. Le cellule saranno essere superinfected ma saranno lyse non fino a questo punto. Se Lisi inizia, l'aggiunta di DNasi e la raccolta mediante centrifugazione deve iniziare immediatamente prevenire il degrado dei fagi.
    9. Aggiungere dnasi a 5 µ g/mL e centrifugare le cellule a 8.000 x g a 4 ° C a pellet. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 10 mL di cloruro di magnesio 1 x TRIS (TM) (50mm Tris pH 7,8, 10mm MgCl 2) tampone con 5 µ g/mL dnasi. Aggiungere 500 µ l di CHCL 3 e vortice ad alta velocità per lisare le cellule. Chiarire mediante centrifugazione a 12.000 x g per 10 min a 4 ° C. decantare il supernatante in una provetta conica da 15 mL e conservare a 4 ° C.

2. Purificazione del fago

Nota: purificazione di saccarosio è in gran parte dipende dalla dimensione del fago. Considerazioni per la massa del fago di essere isolato dovrà essere fatta e adattamenti alle condizioni gradiente eseguita. Titoli virali finali di oltre 10 13 fago/mL sono facilmente realizzabili con questo metodo.

  1. Preparare 12 mL di saccarosio di p/v 5% e il 45% in 1x tampone TM.
  2. Preparare 4 x 5-45% pendenze del saccarosio di pipettaggio 2,5 mL di saccarosio al 45% in 4 provette ultracentrifuga. Top con ~ 2,6 mL di saccarosio al 5%, fermandosi quando il liquido raggiunge 2 mm dal bordo del tubo.
    Nota: Posizionare la punta della pipetta a contatto con la superficie della soluzione di saccarosio e dispensare molto lentamente il liquido. La soluzione di saccarosio accendino galleggerà su più pesanti, formando un confine distinto. Una soluzione correttamente a più strati avrà interfaccia ~ 1 mm se tenuto contro luce sfondo.
  3. Mescolare i gradienti di rotazione tilt-tubo utilizzando un gradiente formando strumento per 43 s a 86° a 23 giri/min. Se non immediatamente necessario, coprire con la pellicola di paraffina e conservare a 4 ° C.
  4. Rimuovere 500 µ l dalla parte superiore di ciascun preparato gradiente di saccarosio con una pipetta da 1 mL e saldo entro ± 0.002 g.
  5. Sospensioni dei fagi piscina da tutte le provette (passo 1.2.9). Utilizzando una pipetta da 1 mL, aggiungere 500 µ l della sospensione portando la punta a contatto con la superficie del liquido e molto lentamente il volume sulla parte superiore del gradiente di saccarosio, facendo attenzione a non mescolare attraverso pipettaggio rapido di dispensazione. Centrifuga a 70.000 x g per 20 min a 4 ° C.
    Nota: Equilibrio i gradienti preparati all'interno di fagi inferiore a ± 0.002 g. possono richiedere fino a 1 h.
  6. Rimuovere le bande dei fagi utilizzando una siringa sterile e cannula smussa.
    Nota: Quando visto di lato, la band dei fagi risulterà spessa e latteo rispetto all'ambiente circostante, circa 5 mm di altezza e situata a metà strada giù la provetta da centrifuga.
    1. Immergere una cannula smussa nella soluzione fino a quando la punta è centrata sul bordo molto superiore della band dei fagi. Rimuovere la band disegnando sullo stantuffo della siringa fino a quando la maggior parte della banda dei fagi è stato rimosso.
  7. Aggiungere il volume di saccarosio con il fago sospeso a 3-4 ultracentrifuga provette. Aggiungere non più di 1,5 mL/tubo. Riempimento a ~ 3-4 mm dalla parte superiore del tubo con freddo 1 x TM. Coprire con la pellicola di paraffina e invertire per mescolare. Luogo torna in un'ultracentrifuga e spin a 145.000 x g per 1 h a 4 ° C a pellet. Fagi più piccoli potrebbero richiedere fino a 2 h.
  8. Velocemente versare il sovranatante e scolare a testa in giù su salviette monouso. Pulire l'interno del tubo con tampone di cotone sterile per rimuovere il surnatante in eccesso.
  9. Dividere 200-400 µ l freddo 1 x TM su tutti i pellet e risospendere durante la notte a 4 ° C; nessuna agitazione è necessaria.
    Nota: Se il pellet non è pulito, per esempio, filante bit della membrana, DNA, ecc., piscina ed eseguire ulteriore centrifugazione in un microcentrifuge a 17.000 x g.
  10. Il giorno prima di fare i titoli, preparare una coltura di Escherichia coli cellule dell'ospite nei media crescita 10ml LB e lasciare in un incubatore agitazione impostato su 250 giri/min e 37 ° C durante la notte. Incubare la quantità appropriata di piastre di coltura a 37 ° C per almeno 1 h prima di fare i titoli dello stock dei fagi.
    Nota: Il numero di piastre per incubare dipende dal numero di diluizioni di brodo dei fagi per essere placcato: ogni diluizione unica dello stock dei fagi richiede due piastre di coltura (per esempio, quattro differenti diluizioni dello stock dei fagi richiedono otto piastre di coltura).
  11. Preparare 100 mL di agar superiore con l'aggiunta di 2,5 g LB e 0,6 g bacto-agar per una bottiglia da 100 mL. Sciogliere i solidi in acqua deionizzata in un volume di 100 mL e autoclave. Dopo autoclave, capovolgere lentamente la bottiglia 6 - 8 volte a omogeneizzare l'agar in tutta la soluzione. Posizionare la bottiglia in bagnomaria a 45 ° C per 15-20 min equilibrare la temperatura .
  12. Preparare diluizioni seriali delle scorte dei fagi con la soluzione LB.
    1. Aggiungere 990 µ l LB a 10 µ l dei fagi stock con una diluizione di 100 volte. Vortice per omogeneizzare. Per un fattore di diluizione di 10, aggiungere 100 µ l di brodo dei fagi a 900 µ l lb Vortex per omogeneizzare.
    2. Ripetere la serie di diluizione come tante volte quante necessario per ottenere un numero numerabile di placche (10-100 placche).
      Nota: Per raggiungere questo obiettivo, diluire lo stock dei fagi 2-3 ordini di grandezza inferiore rispetto al rendimento atteso dei fagi in termini di reazione dei fagi/mL. Ad esempio, se uno stock particolare fago contiene 10 11 infettive dei fagi/mL, piatto lo stock dei fagi 10 8-fold o 10 9-fold diluizione.
  13. Preparare un'area per i titoli dei fagi assemblando le provette di coltura 14 mL (il numero di provette di coltura è uguale al numero di diluizioni stock dei fagi per essere placcato). Porre i campioni d'archivio dei fagi diluiti da passo 2.12 e cellule batteriche dell'ospite dal punto 2.10 su Ice.
  14. Preparare un mix master pipettando 5,25 mL di agar superiore (punto 2.11), 220 µ l diluito campioni dei fagi (passo 2.12) e 50 µ l host cellule batteriche (punto 2.10) ad una cultura di 14 mL del tubo. Tappo del tubo di cultura e vortice ad alta velocità.
    1. Conservare la soluzione rimanente dei fagi a 4 ° C.
  15. Recuperare due piastre di coltura (passaggio 2.10) dall'incubatore a 37 ° C. Aggiungere 2,5 mL di mix master lentamente al centro della prima piastra (senza bolle). Ruotare delicatamente la piastra a mano per distribuire uniformemente il mix master in modo che si estenda la piastra intera cultura. Ripetere con il secondo piatto. Aspettare 20 min per garantire solidificazione dell'agar superiore. Incubare le piastre a 37 ° C per 4-7 h.
  16. Contare le placche e determinare la concentrazione dei fagi per ciascun campione di reazione:.
    Nota: Placche appariranno come cerchi chiaro 1-2 mm nel tappeto opaco della cellula ospite. Vedere la Figura 1 per risultati rappresentativi. Una produzione di successo dei fagi si tradurrà in una concentrazione finale di 10 12 -10 13 fago/mL.

3. Doppio filamento estrazione del DNA del genoma

Nota: diluizione, agitazione, e fasi di centrifugazione devono essere ottimizzati per sviluppare uno strato limite proteine spesse, tinta tra le fasi acquose e fenolo. Questo genera i genomi di purezza più alti che sono privi di proteine contaminanti. La diluizione iniziale dipende dal titolo finale dei fagi. Un magazzino di fago estremamente alto titolo (≥ 13 fago/10ml) potrebbe essere necessario una diluizione di 10-20 volte prima dell'estrazione, mentre scorte titolo basso (~ 10 10 -10 11 fago/mL) possono essere necessario solo un 2 volte o nessuno. Se è difficile formare uno strato di proteina solida nei passaggi successivi o sospensione acquosa è troppo appiccicosa per essere realizzabile grazie all'alta concentrazione di DNA, considerare una diluizione maggiore delle scorte dei fagi prima di continuare l'estrazione. Durante qualsiasi passaggio di genoma-movimentazione, è importante utilizzare wide-bore puntali per pipettaggio qualsiasi fasi acquose. Molti dei fagi genomi sono abbastanza grandi e facilmente frammentati mediante pipetta tosatura. Inoltre, qualsiasi Vortex deve essere espressamente evitato come questo sarà severamente tosare i genomi.

  1. Diluire una parte di stock dei fagi da passo 2.9 a 400 µ l con 1x TM in una provetta di fresco da 1,5 mL.
  2. Aggiungere un volume equivalente di Tris:Phenol:Chloroform per la diluizione. Agitare la miscela delicatamente su un rocker di laboratorio, oppure a mano per 5 min. Centrifugare l'emulsione risultante a 17.000 x g in una centrifuga da banco per 5-10 min
    Nota: È presente un livello di proteine distinte, bianco sulla superficie della fase fenolo sottostante.
  3. Rimuovere la fase acquosa superiore ad un nuovo tubo facendo attenzione a non per disturbare il confine di interfase.
  4. Ripetere passaggi 3.2-3.3 un ulteriore 2 volte per un totale di 3 estrazioni di fenolo. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta e aggiungere un volume equivalente di CHCl 3. Agitare e centrifugare (punto 3.2). Trasferire il campione acquoso di DNA in una provetta pulita.
  5. Stimare il volume di DNA purificato. Aggiungere 0,4 volumi di acetato di sodio 3 M (CH 3 COONa) e 3 volumi di 95% di etanolo (EtOH). Mettere in congelatore a-20 ° C per precipitazione durante la notte. Centrifuga a 17.000 x g in una centrifuga da banco per 10-15 min.
    Nota: Il DNA verrà immediatamente disidratare e diventa visibile come una massa in sospensione nel tubo. Il pellet risultante corretto è bianca e ben confezionato contro il fondo della provetta.
  6. Rimuovere e scartare il surnatante mediante decantazione o pipettaggio. Aggiungere 500 µ l 70% EtOH e agitare delicatamente il tubo fino a quando la pallina galleggia libero dalla parte inferiore del tubo. Centrifugare a 17.000 x g per 5 min, rimuovere e scartare EtOH, avendo cura di non disturbare il pellet.
  7. Ripetere passo 3.6. Aria a secco il pellet il benchtop per 30-60 min. aggiungere 50 µ l ddH 2 O al pellet e incubare per 1h a RT o durante la notte a 4 ° C per risospendere. Determinare la concentrazione di DNA utilizzando misure di assorbimento a 280 nm.
    Nota: Le concentrazioni prevedibili sono 0,5-5 µ g / µ l utilizzando questa tecnica. Dividere per il totale peso molecolare genomico per determinare la concentrazione di genoma finale.

4. Cella-free dei fagi reazione e dei fagi titolo esperimento

  1. preparare g 25 LB medio e 15 g bacto-agar solido, versare in una bottiglia da 1 litro e aggiungere acqua deionizzata a 1 L. Autoclave.
  2. Dopo la sterilizzazione, capovolgere il flacone lentamente 6 - 8 volte avendo cura di evitare la formazione di bolle. L'inversione di bottiglia sarà omogeneizzare il solido di agar in tutta la soluzione di 1 L. Mettere la bottiglia in un bagno di acqua di 58 ° C per 20 min prima di erogare sulle piastre cultura.
  3. Una volta che la temperatura della soluzione LB-agar ha equilibrato, preparare una fiamma accanto le piastre di coltura per sterilizzare l'ambiente vicino le piastre di cultura aperta. Tenere il flacone 1 L nel bagno d'acqua per evitare la solidificazione dell'agar rendendo le aliquote. Aggiungere 25 mL in una piastra di coltura 100 x 15 mm. 1 L produrrà 40 piastre di coltura.
  4. Mettere una piastra di coltura da parte e lasciare solidificare per almeno 1 h a RT; questa piastra verrà utilizzata per la placcatura di cellule dell'ospite. Lasciate le altre piastre di 39 coltura solidificano per 2 giorni alla RT. Store a 4 ° C o utilizzano immediatamente per fare titoli.
  5. Piastra di cellule dell'ospite da striature il ceppo batterico appropriato (ad esempio, host B per T7) che è stato conservato a-80 ° C, sulla piastra di coltura LB-agar. Striscia accanto a una fiamma aperta per evitare l'inquinamento ambientale. Incubare per una notte a 37 ° C. Cellule dell'ospite non hanno alcuna resistenza antibiotica quindi lavorando in un ambiente sterile è essenziale.
  6. Reazione cell-free
    Nota: Le reazioni di TXTL senza cellula sono composti da 33% greggio Escherichia coli estrarre (proteina 8,9-9,9 mg/mL) con l'altro 67% composto da genoma di buffer e dei fagi di reazione. L'estratto grezzo è preparato come precedentemente descritto 15 , 16. Condizioni di reazione finale sono: proteine di 8,9-9,9 mg/mL (da estratto grezzo), 3-6 mM Mg-glutammato, 40-100 mM K-glutammato, 2-4% PEG 8000, 3-4 mM di ciascun amminoacido, preparato come descritto in precedenza 17 e una soluzione di mix energetico, descritto in precedenza 15, composto da 0,33-3,33 mM DTT, 50 mM HEPES, 1,5 mM ATP e GTP, 0,9 mM CTP e UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 0,26 mM CoA, 0,33 mM NAD, accampamento di 0,75 mM, acido folinico 0,068 mM, spermidina 1 mM e 30 mM 3-PGA. Fagi del DNA-tipo richiedono concentrazioni di genoma di 0,5-10 nM e fagi RNA-tipo richiedono una gamma di 50-150 nM. Concentrazioni di reazione finale sono uniche per il particolare fago sintetizzato e cadranno all'interno delle gamme sopra descritte. Per l'ossigenazione ottima delle reazioni, volumi di reazione finale dovrebbero essere tra 10-20 µ l. Ci sono piccole variazioni nel protocollo di reazione, che dipendono dalla forma della molecola genomica. Ad esempio, molecole lineari genoma richiedono un componente aggiuntivo nella reazione di inibire la digestione dei pezzi di DNA lineare dall'enzima recBCD presente nell'estratto grezzo.
    1. Completa il " dettagli di reazione " sezione nella tabella 1 (PhageTXTL_JOVE) inserendo il numero totale di reazioni e volume finale della reazione.
    2. Design l'esperimento determinando il costante componenti e componenti variabili della reazione. Immettere la percentuale di volume frazionale di mix master, che è il rapporto tra il volume totale dei componenti costante reazione al prodotto del volume di reazione finale e il numero di campioni. Immettere il magazzino e le concentrazioni finali dei reagenti di reazione nella " Master Mix reazione ricetta " sezione in PhageTXTL_JOVE. Immettere il magazzino e le concentrazioni finali di contenuti nel reagente variabile da sottoporre a.
      Nota: I volumi dei componenti di reazione automaticamente saranno calcolati sulla base del volume di mix master e il volume finale di ogni reazione individuale.
    3. Rimuovere la quantità necessaria di tubi (indicato nella " tubi scongelare " sezione di PhageTXTL_JOVE.xlsx) di estratto grezzo delle cellule, mix energetico buffer e miscela dell'aminoacido da-20 ° C o da-80 ° C e scongelare su ghiaccio.
      Nota: Una volta scongelati, combinare diverse aliquote del come componenti (se necessario).
    4. Aliquota il volume indicato di greggio estratto, 33% del volume finale della reazione, in un tubo del microcentrifuge.
    5. Preparare il mix master come da tabella 1. Omogeneizzare tutti i componenti sotto " Master Mix reazione ricetta " nel Vortex. Aggiungere il volume appropriato di ciascun componente di greggio estratto.
    6. Se funziona con un fago con genoma di DNA lineare (ad es., T7), aggiungere la reazione 11 1 µM della proteina gam del batteriofago lambda. Vortice per omogeneizzare la soluzione e posizionare la reazione sul ghiaccio per 5 min. Questo inibisce la digestione dei pezzi di DNA lineare dal recBCD complessa, che è endogena in greggio estratto.
    7. Dopo aver aggiunto l'ultimo componente secondo la tabella 1, omogeneizzare la reazione nel Vortex. Dividere il mix master nelle provette microcentrifuga n.
      Nota: Il volume di ogni divisione è il prodotto della percentuale frazionaria mix master volume e il volume finale della reazione. Ad esempio, per una percentuale del volume di mix master frazionaria del 90% e il volume di reazione finale di 12 µ l, il volume di ogni divisione è 10,8 µ l.
    8. Aggiungere i volumi indicati di componenti variabili nella matrice di mix master (Vedi tabella 1). Aggiungere acqua per ciascuna reazione raggiunga il volume di reazione finale desiderata. Omogeneizzare ogni reazione nel Vortex. Incubare le provette microcentrifuga a 29 ° C per almeno 8 h o durante la notte.
  7. Pre-coltura host cellulare
    Nota: la pre-cultura notturna è diluito 50: 1 per garantire che le cellule di host utilizzate per l'esperimento di titolo sono in fase di Mid-log, che aumenta l'efficienza di infezione. Le cellule di Mid-registro sono quindi ri-concentrate di 10 volte e conservate nel ghiaccio.
    1. Utilizzando una pipetta sterile, seminare un tubo di cultura di 5ml LB con colonie delle cellule ospite sano di 3-5. Lavoro vicino a fiamme aperte per evitare la contaminazione.
    2. Incubare la provetta di cultura in agitazione incubatore a 37 ° C e 250 giri/min per 16 h o durante la notte. Le cellule raggiungono la fase di saturazione entro il giorno successivo.
  8. Ospitare cella cultura e preparazione di campioni per titolo dei fagi
    1. dispensare 50ml LB in una beuta da 500 mL e coprire con carta stagnola. Scaldare a 37 ° C per 20 min.
    2. Aliquot 1 mL di cella durante la notte pre-cultura ospitante nel pre-riscaldato da lb. Incubare per 3-4 ore a 37 ° C e agitazione a 250 giri/min.
    3. Centrifugare la coltura delle cellule ospite di 50 mL per 10 min a 5.000 x g. scartare il lb
    4. Risospendere il pellet con freddo (4 ° C) 5ml LB e tenere il ghiaccio.
    5. Un'ora prima di iniziare l'esperimento di titolo, incubare le piastre di coltura a 37 ° C.
      Nota: Ogni reazione unica dei fagi (e il corrispondente fattore di diluizione) utilizzerà due piastre. Inoltre, incubare 4 piastre per controlli sperimentali (vedere la Figura 1 per rappresentante controlli positivi e negativi).
    6. Preparare 100 mL di agar superiore (punto 2.11).
  9. Preparare una diluizione seriale della reazione senza cellula con LB soluzione come descritto in sezione 2.12.
  10. Titolo dei fagi
    Nota: Iniziare a piastra dopo piastre di coltura sono incubate per almeno 1 h e l'agar superiore era nel bagno d'acqua 45 ° C per 15-20 minuti dopo la rimozione dall'autoclave.
    1. Soluzione di reazione-LB titolo la finale senza cellula come descritto nella sezione 2, passi 2.14-2.16.

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Representative Results

Indichiamo quattro risultati rappresentativi. Nella Figura 1, vi presentiamo una serie di controlli negativi per garantire che il sistema TXTL senza cellula e le scorte di DNA dei fagi non sono contaminate con vita cellule di Escherichia coli . Verificare che il sistema TXTL senza cellula è libero di intatto e. coli contaminazione della cellula da placcatura sia una soluzione di reazione non incubate e incubate Sub del DNA genomico (Figura 1A eBdi Figura 1). Se il sistema TXTL senza cellula è stato contaminato con le cellule di Escherichia coli , crescita avrebbe osservato sulla piastra. Inoltre, verifichiamo che la reazione senza cellula e pertanto non tutte le cellule possibili contaminanti, sono responsabili per la sintesi del fago di placcatura reazioni non incubate e incubate con il genoma dei fagi (Figura 1C e Figura 1D). La piastra con la reazione non incubate (Figura 1C) Mostra zero placca, mentre la piastra con la reazione incubata (Figura 1D) Mostra della placca, che indica che il sistema TXTL senza cellula era responsabile dei fagi sintesi.

Nella Figura 2, mettiamo a confronto un omogeneo rispetto al saggio della placca disomogenea. Figura 2 B illustra un gradiente di densità della placca attraverso la piastra di coltura, che è sub-ottima rispetto ad una densità di placca omogenea della piastra in Figura 2A. La fonte di questo osservato è risultato il rapido raffreddamento della master mix di cellule batteriche top agar, campione e host quando erogata su una piastra di coltura durante la parte di titolo dei fagi dell'esperimento. Per evitare una diffusione disomogenea delle placche dei fagi, assicurarsi che le piastre di coltura sono equilibrate a 37 ° C prima di iniziare l'esperimento di titolo dei fagi.

Un passaggio fondamentale per contare correttamente fagi è diluire la soluzione di fago sufficientemente per ottenere tra 50 e 200 placche per piastra (Figura 3). Sotto questa gamma, è difficile determinare le statistiche di vere, e sopra questa gamma, le placche si sovrappongono, impedendo conteggi precisi. Il numero di fagi sintetizzato nel TXTL dipende dalle impostazioni biochimiche, quali la concentrazione di sali (potassio e magnesio), di Crowder molecolari e dei genomi. In Figura 4, vi mostriamo alcuni esempi di test per i fagi T7 e ΦΧ174. Per un fago che replica il suo DNA, come ad esempio T7, si osserva un'alta efficienza di sintesi dei fagi nella reazione senza cellula: tre fagi infettive sono sintetizzati per molecola di genoma nella reazione. Ci si può aspettare una minore efficienza di reazione per un fago che non replica il suo DNA, come ad esempio ΦΧ174: il rapporto del fago sintetizzato infettiva alla molecola del genoma è 1:5.

Figure 1
Figura 1: Placca analisi controlli e produzione dei fagi infettive successo utilizzando un sistema senza cellula reazione (CFR). (A) nessun genoma è stato aggiunto ed è stato effettuato nessun incubazione (0 min come tempo di incubazione) di CFR. La reazione è stata quindi placcata senza host e. coli. Risultato non mostra nessun host praticabile contaminazione delle cellule del CFR. (B) nessun genoma è stato aggiunto e CFR è stato incubato 12h a 29 ° C e placcato senza host e. coli. I risultati non mostrano nessun host praticabile contaminazione delle cellule di CFR, anche dopo incubazione. (C) 1 nM genoma incluso con nessuna incubazione di CFR (0 min come tempo di incubazione) e placcato con host e. coli. Risultato non indica nessuna contaminazione dei fagi della soluzione del genoma. (D) 1 nM genoma incluso e CFR incubate 12 ore a 29 ° C. e placcato con host e. coli. Risultati mostrano replica di successo dei fagi infettive CFR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Omogeneo contro diffusione disomogenea della reazione dei fagi durante l'esperimento titolo. Un possibile effetto di esecuzione di un titolo dei fagi su piastre di coltura non equilibrati a una temperatura di 37 ° C è la diffusione disomogenea di reazione dei fagi attraverso la piastra di coltura. Un buon risultato visualizzati da una diffusione omogenea di reazione dei fagi è mostrato in (A), dove le placche sono distribuite uniformemente su tutta la superficie della piastra. Viene visualizzato un risultato Sub-ottimo in (B), dove le placche sono concentrate nella parte inferiore sinistra della piastra di coltura. Questo problema può verificarsi con il top-agar, reazione dei fagi e mix master cella di host sono distribuiti su una piastra di coltura che non è ad una temperatura di 37 ° C. La maggior parte del mix master si solidifica nella regione inferiore sinistro, e una diffusione omogenea non è possibile. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : L'impostazione di un fattore di diluizione per i titoli di una reazione senza cellula fagica. (A), questo piatto viene visualizzato un numero ragionevolmente numerabile di placche. Il fattore di diluizione utilizzato per la parte di titolo dell'esperimento diluito la resa della reazione dei fagi abbastanza di lasciare un numero numerabile di placche sulla piastra. Al contrario in (B) il fattore di diluizione era troppo basso per quanto riguarda la resa del fago sintetizzato e deve essere regolato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Caratterizzazione della sintesi senza cellula di fagi ΦΧ174 e T7. (A) numero di ΦΧ174 sintetizzato e T7 fagi (PFU/mL: plaquunità di formazione di e per millilitro) come una funzione di PEG 8000 concentrazione nella reazione senza cellula, misurato dopo 16 h di incubazione a 29 ° C. (B) numero di ΦΧ174 sintetizzato e T7 fagi in funzione della concentrazione di glutammato di magnesio nella reazione senza cellula, misurata dopo 16 h di incubazione a 29 ° C. (C) numero del fago sintetizzato ΦΧ174 in funzione della concentrazione del genoma del DNA di ΦΧ174 nella reazione senza cellula, misurato dopo 16 h di incubazione a 29 ° C. (D) numero di sintetizzato fago T7 in funzione della concentrazione di genoma T7 DNA nella reazione senza cellula, misurato dopo 16 h di incubazione a 29 ° C. Tutte le barre di errore visualizzate sono deviazioni standard delle tre prove ripetute. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Table 1
Tabella 1: composizione reazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Seguendo la tecnica in Chen, et al. 14 per SPMC, un passaggio critico è raggiunto nel determinare le condizioni adeguate per superinfezione. Il parametro che controlla maggiormente capacità di un ceppo di host di resistere a superinfezione è frequentemente la concentrazione iniziale del fago d'infezione. Cellule dell'ospite devono essere in fase di crescita logaritmica prima infezione iniziale con una piccola quantità del fago. Alla fine, il fago raggiungerà anche crescita logaritmica e l'obiettivo è quello di consentire i numeri dei fagi a superare rapidamente il conteggio delle cellule, permettendo per le copie multiple del fago in ogni cellula ospite. In questo modo la cellula in uno stato di quasi-stabile dove non subirà lisi. Se questo stato non viene raggiunto, le cellule subiscono lisi CSS, confluenti e rilasciare il loro carico virale. Se superinfezione può essere raggiunto utilizzando le concentrazioni di virale iniziale sopra, è possibile abbassare la molteplicità iniziale dell'infezione di un fattore dieci prima di fare un tentativo successivo. Se lisare cellule dell'ospite prima del raccolto e superinfezione non viene raggiunto, procedere immediatamente con una procedura di purificazione separato. Aggiungere dnasi I a 5 µ g/mL e 500 µ l CHCl3 per finalizzare tutto cellulare lisi. Continuare a ricciolo per altri 5 minuti e poi Centrifugare a 10.000 x g per rimuovere i detriti cellulari. Decantare e centrifugare il supernatante a 75.000 x g per 1-2 h di pellet il fago e risospendere durante la notte in 1 mL di tampone per TM totale 1x a 4 ° C senza agitazione. Durante il test di superinfezione utilizzando un piccolo volume delle cellule, è possibile misurare quanto vicino cellule sono alla lisi da quanto velocemente si lyse quando esposti al cloroformio aggiunto. Se lisare le cellule e la soluzione chiarisce quasi istantaneamente, le pareti cellulari sono molto instabili e le cellule devono essere raccolte immediatamente per impedire Lisi cascata su larga scala. Se il test di lisi entro 1-3 min, i volumi più grandi possono continuare ad superinfect per fino a 2 h, a seconda del locale ceppo di e. coli in uso. Se le cellule non lisare entro 5 min, crescita dei fagi non ha raggiunto per la crescita di Escherichia coli e incubazione primaria dovrebbe continuare. Eseguire nuovamente il test in 30-60 min.

Quando la purificazione dei fagi su un gradiente di saccarosio preparati, il fago apparirà come una band molto spessa, perlescente tra un terzo e due terzi di strada lungo il tubo. Supponendo che un relativamente riuscita lisi e la fase di purificazione cellulare residuo, ci possono essere altri, luce bande ma nessuno di densità o di dimensioni simili. La band grande, opaca contiene il fago e deve essere rimosso dalla soluzione con una siringa sterile e cannula smussa.

Quando si avvia la terza sezione del protocollo, la reazione senza cellula e titolo dei fagi, è meglio usare piastre di coltura fresca (meno di una settimana di età) per la piastra di batteri ospite (dal punto 3.5) e anche le piastre di coltura utilizzate per l'analisi del titolo (dal passaggio 3,21). Ciò promuoverà una maggiore crescita di cellule di batteri ospite e maggiore efficienza di infezione per il titolo dei fagi. Piastre di coltura dei fagi devono essere pre-incubate a 37 ° C per un minimo di 1 h prima di iniziare la parte di titolo dei fagi del protocollo. Senza pre-incubazione delle piastre di coltura dei fagi, la soluzione top-agar (contenente la coltura delle cellule dei fagi e host sintetizzata) non potrà distribuire in modo omogeneo su tutta la superficie della piastra di coltura. Invece, la soluzione top-agar si solidificherà in modo omogeneo sulla superficie (Figura 2b). Questo aumenta la probabilità di fagi multiple localizzazione nello stesso punto, che può causare una sottostima del fago resa nella reazione senza cellula.

Ogni placca rappresenta l'evento di un fago sintetizzato infettare una cellula ospite, replicando all'interno della cellula ospite e la lisi della cellula ospite. Placche crescono in dimensioni durante il periodo di incubazione da progenie dei fagi che infettano vicino cellule dell'ospite dall'evento infezione iniziale. Se non le piastre sono osservate, è possibile che il fattore di diluizione effettuato nel protocollo sezione 4.6 è troppo elevato, con conseguente scarsa probabilità che qualsiasi fago sintetizzato infetta una cellula ospite. Per risolvere questo problema, ridurre il fattore di diluizione di 3-4 ordini di grandezza (o necessario) e ripetere l'esperimento di titolo. Al contrario, il fattore di diluizione potrebbe essere troppo in alto dando in placche che coprono tutta la superficie della piastra di coltura, rendendo impossibile contare il rendimento dei fagi. In questo caso, aumentare il fattore di diluizione di 3-4 ordini di grandezza (o necessario). Per un fago ben caratterizzato, conosciuta la resa della reazione senza cellula e fattore di diluizione solo una per ogni punto di reazione sarà necessario per l'esperimento di titolo. Quando che caratterizzano un nuovo Fago, è preferibile includere fattori di diluizione diversa di 2-3 per ogni punto di reazione, assicurando che uno delle diluizioni produrrà una targa numerabile (vedere la Figura 3 per le differenze tra un numero numerabile e non numerabili di placche su un piatto).

Se nessuna placca è osservata dopo aver modificato il fattore di diluizione del titolo dei fagi, questo potrebbe indicare che la reazione senza cellula era infruttuosa in quanto espressione genica non ha accaduto. Una spiegazione possibile per questo potrebbe essere danni strutturali di reagenti/dei fagi del DNA dovuto l'omogeneizzazione della reazione senza cellula nel Vortex. Per ovviare a questo problema, ripetere la reazione e omogeneizzare toccando delicatamente il tubo di reazione cinque a sette volte con un dito, o mescolando lentamente la reazione con una pipetta di cinque a sette volte.

Il sistema di reazione senza cellula proviene da e. coli e contiene in modo endogeno della polimerasi di RNA di e. coli e il fattore primario di sigma, sigma 70, che si combinano per formare holoenzyme necessario riconoscere il consenso di principale promotore sequenze di geni di Escherichia coli . Inoltre, il sistema di reazione senza cellula può ricapitolare il regime di trascrizione intero fattore sigma fornendo esogenicamente sei altri geni del fattore sigma di e. coli sotto la sequenza di consenso del promotore di sigma 70. In questo modo la capacità di sintetizzare tutti i batteriofagi cui genomi sono compatibili con macchine di trascrizione e traduzione di e. coli. Questo lascia fuori un sottoinsieme del batteriofago che non può essere studiato o sintetizzato con il sistema di reazione senza cellula utilizzato qui.

La piattaforma senza cellula trascrizione/traduzione consente un livello impressionante di controllo e flessibilità delle condizioni di reazione rispetto ai metodi in vivo dello studio. Possiamo accordare finemente molti componenti biochimici e genetici di una reazione dei fagi e osservare direttamente gli effetti in meno di 24h, come mostrato nella Figura 4 per affollamento molecolare. Gli effetti di Crowder molecolare, come PEG, via l'auto-assemblaggio di complessi macromolecolari sono stati teoricamente spiegato e dimostrato in vitro18,19,20. Affollamento molecolare è un'entropia guidato meccanismo che aumenta la costante di associazione di strutture grandi biomolecolari. L'approccio senza cellula consente al ricercatore di sonda complicati processi biologici come la biofisica di auto-assemblaggio con sistemi di modello, come batteriofagi, senza le limitazioni intrinseche del lavoro in vivo .

Questa piattaforma consente inoltre per l'indagine dell'utilità dei fagi in campi applicati. Componenti dei genomi dei fagi possono essere reimpiegati e rapidamente testati in un sistema senza cellula reazione con l'obiettivo di integrare i risultati di nanostrutture romanzo. I batteriofagi possono essere modificati al fine di aumentare la selettività dell'infezione della cellula ospite, che promuoverebbe l'utilità della terapia dei fagi come alternativa per i batteri resistenti agli antibiotici.

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Disclosures

Gli autori dichiarano l'interesse finanziario concorrenti seguenti: Noireaux laboratorio riceve fondi per la ricerca da microarray, un distributore del kit di espressione della proteina senza cellula MYtxtl.

Acknowledgments

Questo materiale si basa su lavori sostenuta dall'Office of Naval Research award numero N00014-13-1-0074 (V.N.), Human Frontier Science Program grant numero RGP0037/2015 (per V.N.) e la Fondazione di scienza binazionale concedere 2014400 (al V.N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultracentrifugation tubes Beckman Coulter 344057
Conical tubes Falcon 352070
Gradient maker BioComp Gradient Master see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.
Syringe and Blunt Cannula Monoject 8881513918 and 888202017
Wide-bore pipette tips Fischerbrand 02-707-134
Plaque counter New Brunswik Scientific Colony Counter Model C-110
Culture tubes Fischerbrand 14-961-33
Cell-free system Mycroarray Inc Mytxtl
BioComp Gradient Master BioComp Instruments Model 105ME
LB agar plate recipe 25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010).

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References

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Bioingegneria problema 126 Cell-free trascrizione-traduzione (TXTL) batteriofago Escherichia coli saggio della placca amplificazione dei fagi purificazione del genoma dei fagi biologia sintetica
Sintesi dei batteriofagi infettive in un <em>e. coli -</em>basato sistema di espressione senza cellula
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Rustad, M., Eastlund, A., Marshall, R., Jardine, P., Noireaux, V. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (126), e56144, doi:10.3791/56144 (2017).

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