Esempio di estrazione e quantificazione simultanea cromatografica di doxorubicina e mitomicina C successivi alla consegna combinazione farmaco in nanoparticelle topi del tumore-cuscinetto
Summary
Questo protocollo descrive un processo analitico efficiente e conveniente di estrazione del campione e determinazione simultanea di più farmaci, doxorubicina (DOX), mitomicina C (MMC) e un metabolita DOX cardio-tossici, doxorubicinolo (DOXol), nel biologico campioni da un modello di tumore al seno preclinici trattati con nanoparticelle formulazioni della combinazione sinergica di farmaci.
Abstract
La chemioterapia di combinazione è usata frequentemente nella clinica per il trattamento del cancro; Tuttavia, gli effetti negativi associati al tessuto normale possono limitare il suo beneficio terapeutico. Combinazione della droga basata su nanoparticelle è stata indicata per attenuare i problemi incontrati dalla terapia di combinazione di farmaco libero. Nostri studi precedenti hanno dimostrato che la combinazione di due farmaci anticancro, doxorubicina (DOX) e mitomicina C (MMC), ha prodotto un effetto sinergico contro entrambi murino e cellule di cancro al seno umano in vitro. DOX e MMC co-caricato polimero-lipidico ibrido nanoparticelle (DMPLN) bypassato varie pompe del trasportatore di efflusso che conferiscono la resistenza del multidrug e migliorato l’efficacia dimostrata in modelli di tumore al seno. Rispetto alle forme di soluzione convenzionale, tale efficacia superiore del DMPLN è stata attribuita alla farmacocinetica sincronizzata di DOX e MMC e droga intracellulare aumentata biodisponibilità all’interno delle cellule del tumore abilitato di nanocarrier PLN.
Per valutare la farmacocinetica e la bio-distribuzione di co-somministrato DOX e MMC sia soluzione gratuita e forme delle nanoparticelle, un metodo di analisi della multi-droga semplice ed efficiente utilizzando inverso-fase ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC) è stato sviluppato. Contrariamente ai metodi precedentemente segnalati che analizzate DOX o MMC singolarmente nel plasma, questo nuovo metodo HPLC è in grado di quantificare contemporaneamente DOX, MMC e un metabolita tossico cardio DOX, doxorubicinolo (DOXol), in varie matrici biologiche ( ad esempio, sangue intero, il tumore al seno e cuore). Una doppia sonda fluorescente e ultravioletti assorbente 4-methylumbelliferone (4-MU) è stato utilizzato come standard interno (I.S.) per il rilevamento di uno stadio di analisi multipla di droga con lunghezze d’onda differenti di rilevazione. Questo metodo è stato applicato con successo per determinare le concentrazioni di DOX e MMC consegnato da approcci di nanoparticelle e la soluzione nel sangue intero e vari tessuti in un modello murino ortotopico seno tumore. Il metodo analitico presentato è un utile strumento per l’analisi pre-clinica di recapito basata su nanoparticelle di combinazioni di farmaci.
Introduction
La chemioterapia è una modalità di trattamento primario per molti cancri ma spesso è associato con gli effetti contrari severi ed efficacia limitata a causa della resistenza ai farmaci e altri fattori1,2,3. Per migliorare il risultato della chemioterapia, regimi di combinazione della droga sono stati applicati nella clinica sulla base di considerazioni come tossicità non sovrapposte, diversi meccanismi d’azione dei farmaci e non-Croce farmaco resistenza4,5 , 6. negli studi clinici, un migliore tasso di risposta del tumore è stato osservato spesso utilizzando simultaneamente amministrato combinazioni di farmaci rispetto a un regime di droga sequenziale consegna7,8. Tuttavia, a causa di sub-ottima bio-distribuzione delle forme di farmaco libero, iniezione simultanea di più farmaci può causare tossicità prominente tessuto normale che supera l’effetto terapeutico9,10,11. Consegna della droga basata su Nanocarrier è stato indicato per alterare la farmacocinetica e la bio-distribuzione di farmaci incapsulati, migliorare il targeting tumorale accumulo12,13,14. Come Recensito in nostri articoli recenti, nanoparticelle co-caricate con combinazioni di farmaci sinergici hanno dimostrato la capacità di attenuare i problemi incontrati da combinazioni di farmaco libero, a causa della loro co-consegna temporale e spaziale controllata di le droghe multiple al tessuto del tumore, consentendo effetti sinergici farmaco contro il cancro cellule4,15,16. Di conseguenza, la superiore efficacia terapeutica e bassa tossicità sono state dimostrate in entrambi gli studi pre-clinici e clinici4,17,18.
I nostri precedenti studi in vitro ha trovato che la combinazione di due farmaci anticancro, doxorubicina (DOX) e mitomicina C (MMC), ha prodotto un effetto sinergico contro parecchie linee di cellule di cancro al seno e, inoltre, co-caricamento DOX e MMC entro nanoparticelle di polimero-lipidiche ibrido (DMPLN) ha superato vari multi-farmaco resistente associato efflusso pompe (per esempio, P-glicoproteina e proteina resistente al cancro al seno)19,20,21. In vivo, DMPLN abilitato co-consegna spazio-temporale di DOX e MMC per siti tumorali e aumentata biodisponibilità di farmaci all’interno delle cellule di cancro, come indicato dalla moderazione della formazione del metabolita DOX doxorubicinolo (DOXol)22. Di conseguenza, il DMPLN enhanced apoptosi delle cellule del tumore, l’inibizione della crescita del tumore e sopravvivenza prolungata ospite rispetto alla libera combinazione di DOX e MMC o un liposomiale DOX formulazione22,23,24, 25.
Analizzando la quantità effettiva di farmaci co-consegnato da un nanocarrier è fondamentale per la progettazione di formulazioni efficaci delle nanoparticelle. Molti metodi sono stati sviluppati per analizzare il livello del plasma di dosi singole di DOX o MMC mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) da solo o in combinazione con spettrometria di massa (MS)26,27,28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. Tuttavia, questi metodi sono spesso richiede molto tempo e poco pratico per la terapia di combinazione come un gran numero di campioni biologici deve essere preparati separatamente per l’analisi delle droghe multiple (a volte tra cui metaboliti della droga). Oltre il legame alle proteine plasmatiche forte di DOX e MMC, i globuli rossi hanno anche una grande capacità di legare e di concentrare molti farmaci antitumorali35,36. Così, l’analisi del plasma per DOX o MMC può offuscare le concentrazioni di farmaco di sangue reale. Il presente lavoro (Figura 1) descrive un semplice e robusto metodo di analisi di droga multiplo mediante HPLC in fase inversa per estrarre contemporaneamente e quantificare DOX, MMC e la DOX metabolita doxorubicinolo (DOXol) da sangue intero e di vari tessuti ( ad esempio, i tumori). È stato applicato con successo per determinare la farmacocinetica e la bio-distribuzione di DOX e MMC nonché la formazione di DOXol dopo somministrazione di farmaci tramite soluzioni gratuite o forme di nanoparticelle (cioè, DMPLN e DOX liposomiale) in un orthotopically impiantato il modello murino di tumore mammario murino dopo somministrazione endovenosa (i.v.) iniezione22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rispetto ad altri metodi cromatografici che permettono la rilevazione di una singolo farmaco specie in un momento, il presente protocollo HPLC è in grado di quantificare contemporaneamente tre composti di droga (DOX, MMC e DOXol) nella stessa matrice biologica senza la necessità di cambiare la fase mobile. Questo metodo di preparazione e l’analisi è stato applicato correttamente per determinare la farmacocinetica e la bio-distribuzione di due sistemi di erogazione del farmaco a base di nanoparticelle (cioè, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono con gratitudine la concessione di attrezzature dalle scienze naturali e ingegneria Research (NSERC) Council of Canada per HPLC, la sovvenzione di funzionamento dalla Canadian Institute of Health Research (CIHR) e canadesi al seno cancro ricerca (CBCR) Alleanza di X.Y. Wu e la borsa di studio di Università di Toronto a chrysantha Zhang e T. Zhang.
Materials
| Doxorubicin | Polymed Theraeutics | 111023 | Anticancer drug |
| Mitomycin C | Polymed Theraeutics | 060814 | Anticancer drug |
| Doxorubicinol (DOXol) | Toronto Research Chemicals | D558020 | Metabolite of DOX |
| 4-Methylumbelliferone sodium salt | Sigma-Aldrich | M1508 | Internal standard |
| Myristic Acid | Sigma-Aldrich | 544-63-8 | Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles |
| Polyoxyethylene (100) Stearate | Spectrum | M1402 | Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles |
| Polyoxyethylene (40) Stearate | Sigma-Aldrich | P3440 | Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles |
| Pluronic F68 (PF68) | BASF Corp. | 9003-11-6 | Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles |
| Ultrasonication (UP100H) | Hielscher, Ultrasound Technology | NA | Nanoparticle preparation |
| Water Bath (ISOTEMP 3016HS) | Fisher Scientific | NA | Nanoparticle preparation |
| Liposomal Doxorubicin (Caelyx) | Janssen | Purchased from the pharmacy Princess Margaret Hospital | Clinically-approved nanoparticle formulation |
| HPLC-graded Methanol | Caledon Chemicals | 6701-7-40 | HPLC mobile phase composition |
| HPLC-graded H2O | Caledon Chemicals | 8801-7-40 | HPLC mobile phase composition |
| HPLC-graded Acetonitrile | Caledon Chemicals | 1401-7-40 | HPLC mobile phase composition |
| Trifluoroacetic Acid | Sigma-Aldrich | 302031 | HPLC mobile phase composition |
| 0.45 μm Nylon Membrane Filter Paper | Whatman | WHA7404004 | HPLC mobile phase preparation |
| 1cc Plastic Syringes | Becton, Dickinson and Company | 2606-309659 | Treatment injection |
| 5cc Plastic Syringes | Becton, Dickinson and Company | 2608-309646 | Tissue collections |
| 30G 1/2 Needles | Becton, Dickinson and Company | 305106 | Treatment injection |
| 25G 5/8 Needles | Becton, Dickinson and Company | 305122 | Tissue collections |
| Sterile 0.9% Saline | Univeristy of Toronto House Brand | 1011 | Tissue perfusion |
| 13 ml Rounded-bottom conical tube | SARSTEDT | 62.515.006 | Prolyprolene, tissue homogenization |
| Alpha Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 12571063 | Cell medium |
| 1 x Phosphate Buffer Saline | Gibco | 10010023 | Tissue homogenization |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100 ML | Tissue homogenization |
| Formic acid | Caledon Chemicals | 1/5/3840 | Adjust pH for extraction solvent |
| Sodium heparin sprayed plastic tubes | Becton, Dickinson and Company | 367878 | Blood collection |
| Analytical Weigh Balance | Sartorius | CPA225D | NA |
| pH meters | Fisher Scientific | 13-637-671 | accumet BASIC |
| Vortex Mixter | Fisher Scientific | 02-215-365 | Vortexing samples at desired speed |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | Fisherbrand | 2043-05408129 | Prolyprolene |
| Model 1000 homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-672 | Tissue homogenization |
| Centrifuge 5702R | Eppendorf | 5702R | Extraction preparation |
| Heated Evaporator System | Glas-Col | NA | Sample reconstitution |
| HPLC Screw Thread Vials | DIKMA | 5320 | HPLC sample injection |
| HPLC Screw Caps with PTFE White Silicone Septa | DIKMA | 5325 | HPLC sample injection |
| HPLC Polypropylene Insert | Agilent Technologies | 5182-0549 | Maximum volume 250 μl, HPLC sample injection |
| Xbridge C18 Column | Waters Corporation | 186003117 | Drug analysis |
| Gradient pump | Waters Corporation | W600 | Drug analysis |
| Auto-sampler | Waters Corporation | W2707 | Drug analysis |
| Photodiode array detector | Waters Corporation | W2998 | Drug analysis |
| Multi λ fluoresence detector | Waters Corporation | W2475 | Drug analysis |
| EMPOWER 2 | Waters Corporation | NA | Data analysis software |
| Scientist | Micromath | NA | Pharmacokinetic analysis |
| Female Balb/c Mice | Jackson Laboratory | 001026 | In vivo |
| EMT6/WT Breast Cancer Cells | Provided by Dr. Ian Tannock; Ontario Cancer Institute | NA | In vivo |
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