Het meten van de mRNA niveaus na verloop van tijd tijdens de gist S. cerevisiae hypoxische reactie
Summary
Hier presenteren we een protocol met behulp van RNA-seq mRNA niveaus volgen na verloop van tijd tijdens de hypoxische reactie van S. cerevisiae cellen. Deze methode kan worden aangepast aan het analyseren van genexpressie tijdens elke cellulaire reactie.
Abstract
Complexe veranderingen in genexpressie bemiddelen doorgaans een groot deel van een cellulaire respons. Elk gen kan expressie met unieke kinetiek veranderen als het gen wordt geregeld door de bijzondere timing van één van de vele prikkels, signalering trajecten of secundaire effecten. Om te vangen van het hele gen werd expressie reactie op hypoxie in de gist S. cerevisiae, RNA-seq analyse gebruikt voor het controleren van de mRNA niveaus van alle genen op specifieke tijdstippen na blootstelling aan hypoxie. Hypoxie werd opgericht door de groeiende cellen in ~ 100% N2 gas. Nog belangrijker is, in tegenstelling tot andere hypoxische studies, zijn ergosterol en onverzadigde vetzuren niet toegevoegd aan de media omdat deze metabolieten genexpressie beïnvloeden. Tijdstippen werden gekozen in de range van 0 – 4 uur na hypoxie omdat die periode de grote wijzigingen in genexpressie vangt. Op elk tijdstip, halverwege log hypoxische cellen werden snel gefilterd en bevroren, beperking van de blootstelling aan O2 en daarmee gepaard gaande wijzigingen in genexpressie. Totaal RNA werd gewonnen uit cellen en gebruikt om te verrijken voor mRNA, die vervolgens werd omgebouwd tot cDNA. Dit cDNA, multiplex bibliotheken zijn gemaakt en acht of meer monsters werden sequenced in één rijstrook van een volgende generatie sequencer. Een pijpleiding na sequencing wordt beschreven, waaronder kwaliteit basis trimmen, lezen toewijzen en het bepalen van het aantal leesbewerkingen per gen. DESeq2 binnen de statistische R-omgeving werd gebruikt om genen die aanzienlijk in één van de hypoxische tijdstippen veranderen te identificeren. Analyse van drie biologische replicatieonderzoeken geopenbaard hoge reproduceerbaarheid, genen van uiteenlopende kinetiek en een groot aantal verwacht O2-genen gereguleerd. Deze methoden kunnen worden gebruikt om te bestuderen hoe de cellen van verschillende organismen reageren op hypoxie na verloop van tijd en aangepast om te bestuderen van genexpressie tijdens andere cellulaire reacties.
Introduction
Veel organismen reageren op hypoxie of lage O2, door gene expression 1,2,3te wijzigen. Dit antwoord helpt cellen omgaan met het ontbreken van een substraat kritisch voor aërobe ademhaling en voor verschillende biosynthetic reacties, maar ook met een veranderende redox staat 4. Verschillende microarray studies uitgevoerd in S. cerevisiae tonen aan dat de mRNA niveaus van honderden genen in reactie op hypoxie 5,6,7,8,9 wijzigen , 10 , 11 , 12. onlangs, RNA-seq gewend was gen expressie wijzigingen na verloop van tijd tijdens hypoxie 13karakteriseren. Hier, de experimentele gegevens worden gepresenteerd en besproken.
Hypoxie kan worden bereikt op verschillende manieren, elk produceren een ander niveau van O2. Hier, hypoxie werd opgericht door voortdurend stroomt ultra-hoge-zuiverheid N2 in kolven, die [O2 verlaagt] ontbonden onmiddellijk met reproduceerbare kinetiek 10. Het is mogelijk dat er sommige O2 moleculen aanwezig die aan metabolisme en gen-expressie bijdragen maar deze omgeving is zeer vlakbij anaërobe beschouwd. Bij gebrek aan O2, kunnen gistcellen niet biosynthesize Heem, ergosterol en onverzadigde vetzuren 4,12,14. Dus, vorige studies hebben opgenomen deze metabolieten bij het kweken van gist zonder zuurstof 5,10,15. Echter, vele hypoxische reacties zijn gemedieerd door uitputting van deze metabolieten en dus het aanvullen van hen keert de hypoxische gen expressie reacties 12,16. Om na te bootsen natuurlijke hypoxie, werden deze metabolieten niet toegevoegd aan de media. In de korte tijd dat cellen werden blootgesteld aan hypoxie zonder de aanwezigheid van deze essentiële metabolieten, was er geen merkbare toename van de dood van de cel (gegevens niet worden weergegeven), noch een langdurige stress reactie 13.
Het antwoord is ook afhankelijk van de spanning en de genotype. Bijzonder belangrijk zijn de allelen van het bekende regulatoren van hypoxische reacties 2. De achtergrond van de stam S288C is zeer gewenst, zodat de resultaten kunnen worden vergeleken met de andere genomic studies uitgevoerd met deze stam. S288C bevat echter een gedeeltelijke verlies-van-functie allel van de HAP1 gen 17, een transcriptionele regelgever die kritisch zijn voor de hypoxische reactie. Dit allel werd hersteld in S288C met behulp van een wildtype kopie van de Σ1278b stam achtergrond 11.
Genexpressie is sterk afhankelijk van de cellulaire omgeving. Dus, bij het uitvoeren van genoom-brede mRNA analyse, het is belangrijk om te handhaven van een constante omgeving terwijl variërend van een andere parameter zoals tijd, stimulans of genotype. Overweeg zeer reproduceerbaar om resultaten te bereiken, deze drie praktijken voor de studie en alle van haar biologische of technische wordt gerepliceerd. Eerst, de dezelfde experimenter(s) moet de studie uitvoeren, aangezien de technische praktijken onderzoekers kunnen verschillen. Ten tweede, dezelfde batch van ingrediënten moet worden gebruikt in de groei-media zoals elke partij heeft een iets andere samenstelling die genexpressie kan beïnvloeden. Ten derde, te minimaliseren celcyclus gevolgen, elk tijdstip moet bestaan uit asynchrone cellen in de mid log fase van groei (1-2 x 107 cellen/mL).
Wanneer karakterisering van een complexe reactie als de gen expressie reactie op hypoxie, is een tijd cursus gunstig voor het bepalen van de kinetiek van diverse evenementen. Specifieke tijdstippen moeten worden gekozen dat zal vangen de grote veranderingen van het antwoord. In deze studie werden tijdstippen tussen 0 en 4 h waargenomen, omdat afgelopen experimenten bleek grootschalige wijzigingen in genexpressie tijdens deze periode 13.
Voor het meten van globale genexpressie, was RNA-seq gebruikte 18,19. Deze methode maakt gebruik van volgende-generatie sequencing om te bepalen van de relatieve overvloed van elke genes transcript. Ten opzichte van DNA microarray analyse, vertoont RNA-seq hogere gevoeligheid (om te detecteren minder overvloedige afschriften), een groter dynamisch bereik (voor het meten van grotere veranderingen van de vouw) en superieure reproduceerbaarheid (te nauwkeurig volgen genexpressie na verloop van tijd). Meestal is de meest cellulaire RNA ribosomaal RNA die zoveel methoden zijn ontwikkeld om te verrijken voor specifieke RNA soorten 20. Hier, kunnen poly-T kralen werden gebruikt voor het zuiveren van poly-A-bevattende mRNA afschriften, hoewel de verschillende commercieel – beschikbare rRNA uitputting kits ook effectief in het mRNA verrijking.
Hier, werd de S. cerevisiae gen expressie reactie op hypoxie gekenmerkt. Cellen werden blootgesteld aan hypoxie en vervolgens bemonsterd op acht tijdstippen (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 en 240 min). Te bevestigen van de reproduceerbaarheid en statistisch gewijzigde afschriften, werden drie biologische replicatieonderzoeken uitgevoerd. RNA was gewonnen door verstoring van de mechanische en zuivering van de kolom en vervolgens verwerkt voor RNA-seq analyse. De pijpleiding na sequencing wordt beschreven en programmering scripts worden verstrekt waarmee exacte replicatie van de analyses uitgevoerd. Specifiek, werden Trimmomatic 21, TopHat2 22HTseq 23, de R statistische milieu 24en de DESeq2 pakket 25 gebruikt om de RNA-seq-gegevens te verwerken en te identificeren 607 genen die aanzienlijk tijdens veranderen Hypoxie. Belangrijkste componenten analyse (PCA) en de expressie van genen voor de duplo’s aangegeven de reproduceerbaarheid van de techniek. Clustering en heatmaps bleek brede expressie kinetiek, terwijl gen ontologie (GO) analyse toonde aan dat vele cellulaire processen, zoals aërobe ademhaling, in de reeks van zuurstof-gereglementeerde genen zijn verrijkt.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie werd de mRNA niveaus voor alle genen gemeten tijdens hypoxie in de gist S. cerevisiae. Het doel was om te analyseren hoe mondiale gen expressie veranderingen als gevolg van de groei in een gecontroleerde, in de buurt van zuurstofvrije omgeving. Verschillende stappen gezet om ervoor te zorgen dat de hier beschreven methode zorgvuldig gecontroleerde en reproduceerbaar was. Eerst, cellen werden blootgesteld aan een duidelijk omschreven hypoxische omgeving: 99,999% N2 in rijke media (YPD). …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken het Lewis-Sigler Instituut voor integratieve Genomics Sequencing Core faciliteit aan de Princeton Universiteit voor technisch advies en voor RNA bibliotheek voorbereiding en rangschikken. Dit werk werd gesteund door subsidies van Rowan-universiteit en NIH NIGMS R15GM113187 aan M.J.H.
Materials
| Enclosed dry incubator | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | Set at 30°C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures. |
| Micro-analysis Filter Holder | Millipore | XX1002530 | 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125mL filtering flask |
| Strong vacuum | Edwards | E-LAB 2 | The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here. |
| 1000-mL flask | To act as vacuum trap. | ||
| ~2-foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in | Tygon | 38TT | Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system. |
| High-pressure N2 gas tank | 99.999% purity, >1000psi, with a regulator and gas flow controller | ||
| Autoclaved 500mL flask | Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain. | ||
| Autoclaved 250mL flasks | Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps. | ||
| Flask stoppers (size 6, two holes with 5mm diameter) | Sterilized with 70% ethanol. One for each flask. | ||
| Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm | Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes. | ||
| ~25-cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm | Tygon | E-3603 | One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol. |
| Sterile filter discs | Millipore | HAWP02500 | 25mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point |
| Sterile dH2O (~100mL) | |||
| 1-mL cuvettes | For measuring OD600 (i.e., cell concentration) | ||
| 50-mL sterile centrifuge tubes | One for each time point | ||
| Clean and sterile tweezers | |||
| liquid nitrogen | For freezing cells | ||
| acid-washed beads | Sigma | G8772 | Keep at 4°C for lysing cells |
| Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA column purification |
| Qiagen RLT buffer | Prepare by adding 10µL of β-Mercaptoethanol per 1mL of RLT buffer, keep at 4C. | ||
| 2-mL collection tubes | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RPE | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RW1 | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| DNase I stock and working solutions | Qiagen | 79254 | The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20°C) in single-use aliquots (80µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen. |
| Buffer RDD | Qiagen | included in the Qiagen DNase Kit | |
| Ice cold 2-mL screw-cap tubes | For lysing cells during RNA extraction | ||
| bead mill homogenizer | Biospec Mini-Beadbeater-24 | 112011 | Keep in cold room |
| Bacto Peptone | BD | DF0118 | for liquid YPD media |
| Bacto Yeast Extract | BD | DF0886 | for liquid YPD media |
| glucose | Fisher | D16 | for liquid YPD media |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher | Q32856 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fisher | Q32853 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM RNA Assay Kit | Thermo Fisher | Q32855 | for measuring nucleic acid concentration |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | for measuring nucleic acid concentration |
| Commercial electrophoresis system | Agilent | Bioanalyzer 2100 | for measuring nucleic acid quality |
| Next-generation sequencer | Illumina | HiSeq 2500 | for sequencing libraries |
| automated liquid handling system | Wafergen | Apollo 324 | for creating sequencing libraries |
| PrepX PolyA mRNA Isolation Kit | Wafergen | 400047 | for isolating mRNA from total RNA |
| PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit | Wafergen | 400039 | for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA |
| Barcode Splitter | https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d | ||
| Samtools, which includes the gzip command | http://www.htslib.org/download/ | ||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Bowtie2 (installed before TopHat) | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | ||
| TopHat | https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml | ||
| HTSeq | http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html | ||
| R (installed before R Studio) | https://cran.rstudio.com | ||
| R Studio (free version) | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
References
- Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
- Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
- Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).
- Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
- Ter Linde, J. J., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).
- Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).
- Kwast, K. E., et al. Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response. J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).
- Becerra, M., et al. The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions. Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).
- Lai, L. -. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media. Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).
- Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae. Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).
- Hickman, M. J., Winston, F. Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor. Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).
- Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 188 (2), 325-338 (2011).
- Bendjilali, N., et al. Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response. G3. 7 (1), 221-231 (2017).
- Chellappa, R., et al. The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator. J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).
- Abramova, N. E., et al. Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 157 (3), 1169-1177 (2001).
- Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast. Cell. 120 (6), 831-842 (2005).
- Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. A "natural" mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1). Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).
- Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11 (10), R106 (2010).
- Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 17 (1), 13 (2016).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–A Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).
- . R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: https://www.R-project.org (2015)
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Brown, T., Mackey, K., Du, T. Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization. Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).
- Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).
- Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).
- Hothorn, T., Everitt, B. S. . A Handbook of Statistical Analyses using R. , (2014).
- Saldanha, A. J. Java Treeview–extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Davies, B. S. J., Rine, J. A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 174 (1), 191-201 (2006).
- Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae. Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).
- Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -. M. Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).
- Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains. 유전학. 200 (2), 505-521 (2015).
- Collart, M. A., Oliviero, S., et al. Preparation of yeast RNA. Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).
- Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).
- Martini, P., et al. timeClip: pathway analysis for time course data without replicates. BMC Bioinf. 15, (2014).
- Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach. BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).
