הערכה של מאפייני תאי אנדותל באמצעות תרבית תאים 3D ושאינם-anticoagulated דם קרישה ואנטי דלקתיות
Summary
אנו מציגים במבחנה מודל המאפשר את מחקר וניתוח של קרישה בדם שאינו anticoagulated כולה,… בדיקות דם במערכת תלוי אפקט נוגד קרישה הטבעי של תאי אנדותל בריאים והתוצאה תא אנדותל הפעלת הקרישה.
Abstract
In vivo, תאי אנדותל מכריעים עבור בדיקות דם טבעי של כלי-דם. כתוצאה מכך, תאי אנדותל הפעלת מוביל דם קרישה. תופעה זו נצפית במצבים קליניים רבים, כמו השתלת איברים בנוכחות נוגדנים אנטי-תורם הקבועים מראש, כולל השתלת איברים מבעלי חיים, כמו גם איסכמיה/פגיעה reperfusion לפציעה. על מנת להפחית לניסויים בבעלי חיים על פי 3R סטנדרטים (צמצום, החלפה, עידון), במבחנה הדגמים כדי לחקור את ההשפעה של תאי אנדותל הפעלה על קרישת הדם יהיה רצוי מאוד. עם זאת, מערכות סטילס משותף התרבות תאי אנדותל מספקות יחס השטח לבנפח של 1-5 ס מ2 של אנדותל לכל מיליליטר דם, וזה לא מספיק עבור בדיקות דם טבעי, בתיווך אנדותל. Culturing תאי אנדותל על חרוזים microcarrier עשוי להגדיל את היחס בין השטח לבנפח 40-160 ס מ2/mL. יחס מוגבר זה מספיקה להבטיח את בדיקות דם “טבעי” של דם מלא, כך ניתן למנוע את השימוש תרופות נגד קרישת דם. כאן במבחנה microcarrier מבוססי מערכת מתואר לחקור את ההשפעות של ההנדסה הגנטית של תאי אנדותל חזירי על קרישת הדם של דם אנושי שלם, של אי-anticoagulated. ב וזמינותו המתואר, ראשי חזירי תאי אנדותל של אבי העורקים, או פראי סוג (WT) או הטרנסגניים האנושית CD46, thrombomodulin, היו גדל על microcarrier חרוזים, אז נחשפים דם אנושי טרי מצוירות בלתי-anticoagulated. דגם זה מאפשר מדידה של כימות של שחרור ציטוקינים, כמו גם הפעלת סמנים של המשלים קרישה בפלסמת הדם. בנוסף, הדמיה של תאי אנדותל מופעל, בתצהיר של immunoglobulins, חלבונים המשלים, קרישה על החרוזים endothelialized בוצעו על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. Assay הזה יכול לשמש גם כדי לבדוק תרופות אשר אמורים למנוע הפעלת תאי אנדותל ובכך, קרישת הדם. על הפוטנציאל שלו כדי להפחית את מספר בעלי החיים שבהם משתמשים לחקירות כאלה, וזמינותו המתואר הוא קל לביצוע, לשחזור באופן עקבי.
Introduction
אנדותל כלי הדם מורכב טפט של תאי אנדותל (EC) אשר קו לומן של כלי הדם. במצב פיזיולוגי, EC השבתה הדרגתית אחראים על קיום קרישה וסביבה אנטי דלקתיות. 1 זה מתווך על ידי הביטוי של קרישה, חלבונים אנטי דלקתיות על פני EC. לדוגמה, הפעלת EC הנגרמת על ידי פגיעה reperfusion/איסכמיה פציעה או כלי דם על ידי דחיית (קסנו-) מושתלים איברים תוצאות שינוי פני השטח אנדותל קרישה, מצב דלקתי של פרו-מקריש, הפרו דלקתיים המדינה. 1
ככל האפשר את האינטראקציה מרתק ומורכב בין הגורמים אנדותל, קרישה, מודלים במבחנה המחקות כמו המצב ויוו הם רצוי מאוד. מגבלה נפוצה המאפיינת קונבנציונאלי במבחנה מבחני קרישת הדם הוא השימוש של דם anticoagulated, מה שהופך את הניתוח של קרישת הדם בתיווך ההשפעות המפרך, אפילו recalcification של דם מלא citrated לא יכול להתרבות תוצאות השגה עם דם טרי ללא-anticoagulated. 2 . חוץ מזה, במערכות תרבות מסורתית תא שטוח-מיטה זה בלתי אפשרי לנצל את מאפייני אנדותל קרישה כמו משטח תא אנדותל מספיקות לכל נפח הדם לא יכול להגיע. המודל המוצג כאן מתגבר על מגבלות אלה על-ידי culturing EC על פני השטח של microcarrier כדורי חרוזים, כך יחס השטח-כדי-דם EC של > /mL216 ס”מ ניתן להגיע, בדומה למצב רבים קטנים או ורידים, ו אשר תוארה להיות מספיק כדי לאפשר בדיקות דם “טבעי” של הדם על ידי השטח EC. 3 , 4 דם יכול לשמש ללא קרישה נוסף בהגדרה זו. ניתן לאסוף דגימות דם במהלך הניסוי, ציטוקינים, פקטורי קרישה, סמני הפעלת המשלים מסיסים ועוזרת לכמת. יתר על כן, חרוזים מצופים EC microcarrier עשוי להיות מנותח התצהיר המשלים, אימונוגלובולינים, כמו גם הביטוי של EC הפעלה סמנים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. יישום מעניין נוסף כולל בדיקה של תרופות אשר אמורים למנוע הפעלת תאי אנדותל ובכך, קרישת הדם. 5 . אף על פי מודל זה לחלוטין לא יכול להחליף ניסויים בבעלי חיים, הוא מציע שיטה לבדוק השערות ספציפיות תפקודית שמחוץ באמצעות תאים, ובכך להפחית את מספר בעלי החיים שבהם משתמשים במחקר בסיסי על איסכמיה/פגיעה reperfusion השתלת פציעה או (קסנו).
המודל שתואר שימש לחקות השתלת איברים מבעלי חיים הגדרת אילו חזירי תאי אנדותל של אבי העורקים (PAEC) גדל על החרוזים microcarrier, מודגרות עם דם אנושי שלם, ללא anticoagulated. PAEC הטרנסגניים שונים, נושאת מספר גנים אנושיים כגון CD46 הסדרת מערכת המשלים ו/או thrombomodulin (hTBM) הסדרת במערכת קרישת הדם, נותחו עבור מאפייניהם נוגד קרישה. מערכות הפעלה, המשלים, קרישה תא אנדותל הדוק נשלט, בינהם. 6 לכן חשוב להבין כיצד התאים הטרנסגניים שונים מתנהגים לאחר חשיפה דם אנושי ביחס אדהזיה מולקולה ביטוי ושחרור ציטוקינים, ששפך של glycocalyx ושל אובדן של חלבוני קרישה. 7
Protocol
Representative Results
Discussion
המודל המוצג כאן מתאים קרישה הקשורות לימודי המאפשר הניתוח של היבטים שונים של קרישת הדם והאינטראקציה שלו עם לכלכלת 8 במחקר השתלת איברים מבעלי חיים, זוהי מערכת שימושי כדי לבדוק את מאפייני קרישה שונים ECs חזירי מהונדסים לאחר דגירה עם דם אנושי 9.
השלבים ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית (SNSF, 320030_156193 מענק מס). המחברים תודה ד ר בנואה Werlen למתן את החרוזים microcarrier Biosilon. אנו מודים גם פרופסור הנס פיטר קולר, פרופסור אנדרה Haeberli לקבלת עזרה בהתקנת הדגם חרוז microcarrier.
Materials
| PAEC | Isolated from pig aorta in our Lab | ||
| Microcarrier beads (Biosilon) | Thermo Fisher Scientific | 160-250 | |
| Collagen I, Bovine | Gibco | A10644-01 | |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Sigma | M7528 | |
| RPMI | Gibco | 32404-014 | |
| Neutral tubes | Sarstedt | 02.1726.001 | |
| Polypropylene tubes | Simport | T406-2A | |
| Stirrer flasks | Tecnomara | ||
| Biological stirrer | Brouwer | MCS-104S | |
| Rat anti CD31 | R&D Systems | MAB33871 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-rat IgG-Cy3 | Jackson Immuno Research | 112-166-003 | Dilution 1:500 |
| Goat anti VE-cadherin | Santa Cruz | sc-6458 | Dilution 1:100 |
| Rabbit anti vWF | DAKO | A0082 | Dilution 1:100 |
| Dk anti Gt IgG – Alexa 488 | Molecular Probes | A11055 | Dilution 1:500 |
| Goat anti Rabbit – FITC | Southern Biotech | 4050-02 | Dilution 1:500 |
| DAPI | Sigma | 32670-25MG-F | Dilution 1 µg/mL |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Concentration: 10% in cell culture medium |
| Needle | Becton Dickinson | 367286 | Size: 0.8×19 mm (21ɢ 3/4") |
| Adapter | Sarstedt | 14.1205 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | |
| Image analysis software | Image J | Available for free at: https://imagej.net | |
| Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix | PromoCell | C-39216 | 2mL in 500mL of DMEM |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| Heparinun natricum | Drossa Pharm AG | Stock concentration: 5000 U.I./ mL | |
| Chamberslides | Bioswisstec AG | 30108 | |
| CaCl2 x 2H2O | Merck | 2382.0500 | |
| MgCl2 x6 H2O | Merck | 1.5833.1000 | |
| Tween 20 | Axon Lab AG | 9005-64-5 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Glycergel mounting medium | Dako | C0563 |
References
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
- Rajwal, S., Richards, M., O’Meara, M. The use of recalcified citrated whole blood – a pragmatic approach for thromboelastography in children. Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).
- Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation. Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).
- Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro. J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).
- Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood. Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).
- Cowan, P. J., d’Apice, A. J. Complement activation and coagulation in xenotransplantation. Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).
- Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).
- Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces. Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).
- Bongoni, A. K., et al. Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions. Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).
- Miyazaki, Y., et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood. 88, 3456-3464 (1996).
- Wuensch, A., et al. Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs. Transplantation. 97, 138-147 (2014).
