DNA polimeraz etkinliği tahlil Akrilamid Jel Elektroforez tarafından görüntülenmiştir yakın kızılötesi floresan etiketli DNA'yı kullanarak
Summary
Bu iletişim kuralı DNA polimeraz yakın kızılötesi fluorescently etiketli DNA Jel Elektroforez ve jel görüntüleme kullanarak değişiklikleri gözlem yoluyla değiştirilmiş DNA sentezi karakterizasyonu açıklar. Akrilamid jelleri yüksek kararlılık düşsel boyutuna bağlı olarak farklı fiyatlara geçiş kısa nükleik asitler ayrılması için kullanılır.
Abstract
Herhangi bir enzim için sağlam, nicel yöntemler hem yerli hem de mühendislik enzimleri karakterizasyonu için gereklidir. DNA polimeraz için DNA sentezi polyacrylamide Jel Elektroforez tarafından takip bir vitro DNA sentez yöntemi kullanarak karakterize edilebilir. Bu tahlil doğal DNA ve değiştirilmiş DNA (M-DNA) sentezi ölçmek için hedeftir. Bu yaklaşımlar ile tek nükleotid kararlılık, enzimatik Oligonükleotid sentezi sırasında tek tek adımları gözlem etkinleştirme oligonucleotides çözmek için özellikle yararlıdır. Bu yöntemleri bir dizi biyokimyasal ve biyofiziksel özellikleri gibi kararlı durum hızı sabitler tek tek adımları DNA sentezi, DNA sentezi ve DNA bağlama benzeşme hata oranı ölçümü değerlendirilmesi için uygulandı. Dahil ancak bununla sınırlı olmamak üzere, değiştirilmiş nükleozit trifosfatlardan (NTP), M-DNA, ve/veya mutant DNA polimeraz, çift etkili bir şekilde değerlendirilebilir substrat DNA polimeraz göreli yarar bileşenleri kullanılarak değiştirilebilir. Burada, geleneksel olmayan astar DNA stratejileri yakın-kızılötesi fluorescently DNA etiketli gibi etiketleme karşılamak için yapılması gereken değişiklikleri içeren tahlil ayrıntılı. Ayrıca, dökme Akrilamid jel için çok önemli teknik adımları ayrıntılı olması ve çalışan, hangi sık sık teknik olarak zor olabilir.
Introduction
DNA polimeraz doğru ve etkili DNA sentezi gerçekleştirir ve genom bütünlüğünü korumak için gereklidir. Nükleotit saniyede yüzlerce hata yapmadan sentez yeteneği Ayrıca moleküler biyoloji ve biyoteknoloji DNA polimerazlar temel araçları sağlar. Ancak, bu özellikler de M-DNA yüzeylerde uygulamalarda sınırı; Genel olarak, doğal DNA polimerazlar birçok potansiyel olarak değerli M-DNA yüzeylerde, büyük olasılıkla nedeniyle standart olmayan yüzeylerde vivo içindekullanarak karşı yüksek seçici basınç için sentez olamaz. Birçok grup mutant DNA polimerazlar M-DNA sentezi1a,2,3,4,5/ yetenekli üretmeye yönlendirilmiş evrim yaklaşımlar geliştirdik; Bu çabalar DNA6,7,8Biyoteknolojik yarar genişletmiştir.
Mutant DNA polimerazlar M-DNA, sentez yeteneği değerlendirmek için biz9,10ve diğer11,12,13 genellikle DNA’ın vitro ölçümler kullanın polimeraz etkinlik, bu el yazması açıklanmıştır. Bu deneylerde, DNA polimerazlar bir etiketli astar/şablonu çift yönlü ve nükleozit trifosfat yüzeyler ile birlikte inkübe; Ürünler Jel Elektroforez tarafından değerlendirilir. Deneysel sorularınıza, mutant DNA polimeraz, değiştirilmiş astar bağlı olarak, değiştirilen şablonlar veya değiştirilmiş nükleozit trifosfatlardan, sistematik biyokimyasal değerlendirme mutant enzim aktivitesinin etkinleştirme kullanılabilir.
Tarihsel olarak, bu deneyleri DNA sentezi izlemek için bir 5′ radyoaktif etikette yararlanmıştır; En çok 32P ve 33P kullanılmıştır; genellikle, etiketleme T4 polinükleotit kinaz11kullanarak elde edilir. Ancak, sonlu yaşam ömrü ve radyoaktif etiketleri ve güvenli ellerinde nispeten yüksek maliyet nedeniyle, bizim grup yerine sentetik 5′ yakın kızılötesi fluorophore DNA etiketli kullanır. Nispeten düşük maliyetli yakın kızılötesi jel Imager kullanarak, önceki çalışmalar radyoaktif etiketleri (yayınlanmamış sonuçları) kullanarak benzer algılama sınırları gözlemledim. Başarıyla gözlemler9yeniden oluşturduktan ve biz daha önce ölçülen hızı sabitler (yayınlanmamış sonuçları) ile herhangi bir büyük nicel fark gözlemledim değil.
DNA boyutunu ve böylece, DNA sentezi ölçüde çözümlemek için orijinal Sanger sıralama14 Kapiler Elektroforez15gelişiyle önce için gelişmiş polyacrylamide Jel Elektroforez yöntemleri güveniyor. Ayırma ve hareket etme mesafe moleküler ağırlık ölçüsü kullanılabilir; geniş format, dikey polyacrylamide jeller DNA oligonucleotides değişen uzunlukları nicel gözlem etkinleştirme tek nükleotid çözünürlük elde edebilirsiniz.
Toplu olarak, bu deneyler polimeraz karakterizasyonu için sağlam bir yöntemdir. Zaman nedeniyle hassas doğası reaksiyonlar, hazırlık ve bakım tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek gereklidir. Ayrıca, Akrilamid jel DNA sentezi yanı sıra çok sayıda diğer DNA değiştirme reaksiyonları, tek nükleotid çözünürlükle ölçmek için son derece etkili bir yol olsa da teknik olarak zor olabilir. İletişim kuralı burada Umarım kullanıcıların en yaygın hatalardan kaçınırken bu deneyleri gerçekleştirmeye olanak verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, M-DNA DNA polimeraz aracılı sentezi karakterize etmek için bir tahlil anlatmıştık. Yakın kızılötesi etiketli DNA primerler kullanılarak ve farklı büyüklükteki oligonucleotides gidermek için denaturing polyacrylamide Jel Elektroforez kullanarak, biz sentezi hassas ölçüm etkinleştirme oligonucleotides, tek nükleotid çözünürlük elde edebilirsiniz. Bu yaklaşımlar da enzim (Bölüm 2.1) genel etkinliğini ölçmek için veya tek tek adımları (2.1. adımda takip Not) Michaelis-Menten param…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser TriLink biyoteknoloji (ResearchReward Grant #G139) ve bilimsel ilerleme (Cottrell üniversite Scholar Ödülü #22548) için araştırma kurumu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33×42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
References
- Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
- Chen, T., Romesberg, F. E. Directed polymerase evolution. FEBS letters. 588 (2), 219-229 (2014).
- Leconte, A. M., et al. Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).
- Xia, G., et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).
- Chen, T., et al. Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2′-modified DNA. Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).
- Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. Selection of 2′-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties. J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).
- Taylor, A. I., et al. Catalysts from synthetic genetic polymers. Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).
- Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. Selection of 2′-deoxy-2′-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity. Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).
- Schultz, H. J., et al. Taq DNA Polymerase Mutants and 2′-Modified Sugar Recognition. 생화학. 54 (38), 5999-6008 (2015).
- Rosenblum, S. L., et al. Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates. Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).
- Creighton, S., Goodman, M. F. Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase. J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).
- Joyce, C. M., Benkovic, S. J. DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints. 생화학. 43 (45), 14317-14324 (2004).
- Leconte, A. M., et al. Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet. J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Karger, B. L., Guttman, A. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).
- Lawyer, F. C., et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5′ to 3′ exonuclease activity. PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).
- Lawyer, F. C., et al. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).
- Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity. 생화학. 30 (3), 804-813 (1991).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26 (10), 1135-1145 (2008).
- Larsen, A. C., et al. A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics. Nat Commun. 7, 11235 (2016).
- Cozens, C., et al. Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2′-5′ Linkages. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).
