Summary

Rejenerasyon için gerçek zamanlı hücre Analyzer donatılmış dizilmiş altın Microelectrodes

Published: March 12, 2018
doi:

Summary

Bu iletişim kuralı ticari dizilmiş altın microelectrodes ofmicrochip tabanlı yüksek çalışan maliyeti deneyleri tasarruf amaçlı bir hücre etiket ücretsiz analyzer için donatılmış yeniden oluşturmak için genel bir strateji açıklar. Rejenerasyon işlemi tripsin sindirim, etanol ve su ve mikroçip tekrarlanan kullanımı sağlar bir iplik adım ile durulama içerir.

Abstract

Çünkü biyokimyasal çalışma deneysel hayvan kullanımını gerektirmez için etiket içermeyen hücre tabanlı tahlil avantajlıdır. Klasik biyokimyasal deneyleri daha hücreleri fizyolojik koşullar altında hakkında daha dinamik bilgi sağlamak yeteneği nedeniyle, elektrik empedans ilkesine dayanarak bu etiket ücretsiz gerçek zamanlı hücre tahlil geçmişte sırasında daha fazla ilgi topluyor on yıl. Ancak, onun pratik kullanımı nispeten pahalı maliyet pahalı sarf tek kullanımlık altın mikroçip hücre analyzer için kullanılan ölçü nedeniyle sınırlı olabilir. Bu protokol için bir ticari etiket içermeyen hücre analyzer için donatılmış dizilmiş altın microelectrodes yeniden oluşturmak için genel bir strateji geliştirdik. Rejenerasyon işlemi tripsin sindirim, etanol ve su ve bir iplik adım ile durulama içerir. Önerilen yöntem test edilmiş ve en az üç kez, yenilenme ve ticari elektronik plakaların tekrarlanan kullanımı için etkili olduğu gösterilmiştir hangi gerçek zamanlı hücre deneyleri yüksek çalışan maliyeti üzerinde Kaydet araştırmacılar yardımcı olacaktır.

Introduction

Sayesinde onun verimli ve daha az emek yoğun deneysel işlem, etiket içermeyen hücre tabanlı teknoloji proteomik1,2 açıdan gibi analitik hem de eleme amaçlı son on yılda hızlı büyüme tanıklık etmiş , ilaç teslim3, vb4,5 ile karşılaştırıldığında geleneksel biyokimyasal yöntemlerle hücre analizi, etiket ücretsiz gerçek zamanlı hücre tahlil Giaever ve arkadaşları tarafından daha önce geliştirilen prototip6 ile yönelik elektrik sinyal değişiklikleri nicel bir şekilde sürekli ölçümü hücre büyümesini veya geçiş izni hücre bağlı mikroçip yüzeyinde kayıt prensibi temel alır. Bu stratejiyi, gerçek zamanlı hücre tanıttı7,8 ve son zamanlarda bir ticari gerçek zamanlı hücre analyzer (RTCA) (RT-CES) sistem elektrik empedans tabanlı algılama ilkesini kullanarak oldu algılama elektronik başlatıldı Laboratuvar araştırma9için.

Ticari gerçek zamanlı hücre analyzer ağırlıklı olarak hangi inkübe hücre hücre çoğalması, geçiş, canlılığı, morfoloji ve bağlılık dahil fizyolojik değişiklikler sonucu hücre uyarılmış sinyalleri, elektrik empedans, okur. yüzey mikroçip10,11. Böyle elektrik sinyalleri daha fazla hücre dizin (hücre durumu değerlendirmek için CI) adlı bir boyutsuz parametre Çözümleyicisi tarafından dönüştürülür. Empedans mikroçip değişikliği esas olarak kapalı hücre elektrot/çözüm arabirimi, yerel iyonik ortam yansıtır. Bu nedenle, hücre analyzer analitik performansını dayanır ağır çekirdek algılama birimi üzerinde dizilmiş altın microelectrodes kılan tek kullanımlık kristallerden mikroçipler (Yani, sözde elektronik plakaları, örneğin, 96/16/8-iyi), lithographically kuluçka kuyu dibinde basılmış. Altın microelectrodes daire-on-line biçiminde (şekil 1) birleştirin ve ekli hücreleri3,12,13 dinamik ve hassas tespiti için izin kuluçka Wells yüzey alanının en kapsayacak ,14. CI çip hücrelerinin daha fazla yüzey kapsama alanı söz konusu olduğunda artırın ve hücre içinde apoptosis kaynaklanan bir toxicant maruz azaltın. Her ne kadar gerçek zamanlı hücre analyzer sitotoksisite11 ve nörotoksisite15 belirlemek ve klasik bitiş noktaları yöntemi daha fazla Kinetik bilgi sağlamak için sık sık kullanılmıştır, tek kullanımlık elektronik costliest tabaklar tüketim maddesi.

Şimdiye kadar muhtemelen gerçeğini dahil16,17, piranha çözüm veya Asetik asit gibi sert rejenerasyon koşulların olması nedeniyle olan elektronik plaka rejenerasyon için kullanılabilir hiçbir yöntem olmuştur. Hangi altın mikroçip elektrik durumunu değiştirebilir 18. Bu nedenle, hafif ve etkili bir yöntem yapışık hücreleri ve diğer maddeler altın chips yüzeyinden kaldırmak için elektronik plaka rejenerasyon işlemi için arzu olacak. Biz son zamanlarda aşındırıcı reaktifler kullanarak tek kullanımlık elektronik plakaları yenilenme amaçlı bir protokol geliştirdik ve rejenere cips elektrokimyasal yanı sıra optik yöntemleri19tarafından karakterize. Tripsin ve etanol gibi laboratuar kolayca kullanılabilir ve ılımlı reaktifler kullanarak, biz iki ana türü yeniden oluşturmak için başarıyla uygulanan ticari elektronik plaka olmadan yan etkiler, yeniden oluşturmak için genel bir yöntem kurduk Elektronik plaka (16 ve L8) kullanılan RTCA için.

Protocol

Not: genel olarak, tripsin sindirim ve etanol ve su ile durulama adım yenilenme süreci içerir. Sindirim zaman kullanılan hücre sayısına göre değişen ve türüne ve kullanılan hücre sayısına bağlı olarak deneysel amaçlar farklı olabilir. Rejenerasyon koşulları optimize etmek için optik ve elektrokimyasal yöntemleri kullanarak rejenere mikroçip kontrol etmelerini rica ederiz. Deney sırasında çözünür ve çözünmez kimyasallar tutulabilir ve burada bu iki tipik durumda bir yenilenme prosedürü …

Representative Results

Altın mikroçip yüzey özellikleri: Bu protokol için kullanılan rejenerasyon yordamlar şekil 1′ de özetlenen. Şekil 2 mikroskobik yüzey taze resimlerini ve elektronik plakaları optik mikroskop tarafından yeniden gösterir. Şekil 2A ve şekil 2C, mikroskobik gözlemler olduğunu hemen hemen ima etti gösterildiği gibi mikro?…

Discussion

Biz mikroçip Tablo 1‘ deki yeniden oluşturulması için çeşitli kullanılabilir yöntemleri17,23,24,25,26 özetlenebilir. Temel olarak, bu yöntemleri cips komple yenilenme güçlü molekül molekül immün kompleks SPR yongaları için kullanılan bu gibi etkileşimleri varlığı nedeniyle elde etmek için nispeten sert deneysel koşulla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

İş Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (U1703118), öncelik akademik Program Geliştirme, Jiangsu yüksek öğretim kurumları (PAPD), Jiangsu Shuangchuang Program, devlet anahtarının açık fonlar tarafından finanse edilen bir proje tarafından desteklenmiştir Laboratuar kemoterapi/Biosensing ve Sharky (2016015) ve Biomacromolecules Ulusal Laboratuvarı (2017kf05) ve Jiangsu Specially-Appointed Profesör projesinin, Çin.

Materials

Rat: Sprague-Dawley Charles River Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) Bio-Rad Cat# MCA275R Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1  Abcam Cat# AB5076 Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67  Abcam  Cat# AB15580 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 Invitrogen Cat# 11055 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 Invitrogen Cat# A-21203 Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 Invitrogen Cat# A-31573 Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining) Thermo Fisher Cat# 28313
Heparan sulfate Galen Laboratory Supplies Cat# GAG-HS01
Heparin Sigma  Cat# M3149
Peptone from milk solids Sigma Cat# P6838
TGF-β2 Peprotech Cat# 100-35B
Murine IL-34 R&D Systems Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol Avanti Polar Lipids Cat# 700000P
Collagen IV Corning  Cat# 354233
Oleic acid Cayman Chemicals  Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid Cayman Chemicals  Cat# 20606
Calcein AM dye Invitrogen Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1 Invitrogen Cat# E1169
DNaseI Worthington Cat# DPRFS
Percoll PLUS GE Healthcare Cat# 17-5445-02
Trypsin  Sigma Cat# T9935
DMEM/F12 Gibco Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin Gibco Cat# 15140-122
Glutamine Gibco Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine  Sigma Cat# A9165
Insulin Sigma Cat# 16634
Apo-transferrin  Sigma Cat# T1147
Sodium selenite Sigma Cat# S-5261
DMEM (high glucose) Gibco Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G Southern Biotech Cat# 0100-20 
Poly-D-Lysine  Sigma Cat# A-003-E
Primaria Plates  VWR Cat# 62406-456
Stock reagents  reconstitution  Concentration used Storage
Apo-transferrin 10 mg/mL in PBS  1:100 -20°C
N-acetyl cysteine 5 mg/mL in H2 1:1,000 -20°C
Sodium selenite 2.5 mg/mL in H2 1:25,000 -20°C
Collagen IV 200 μg/mL in PBS  1:100 -80°C
TGF-b2 20 μg/mL in PBS  1:10,000 -20°C
IL-34 100 μg/mL in PBS  1:1,000 -80°C
Ovine wool cholesterol 1.5 mg/mL in 100% ethanol  1:1,000 -20°C
Heparan sulfate 1 mg/mL in H2O 1:1,000 -20°C
Oleic acid/Gondoic acid Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol  1:1,000 -20°C
Heparin 50 mg/mL in PBS  1:100 -20°C
Solutions  Recipe  Comments
Perfusion Buffer 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Use when ice-cold
Douncing Buffer 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Use when ice-cold
Panning Buffer 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM) DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)  MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. 

References

  1. Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling. Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).
  2. Hillger, J. M., et al. Whole-cell biosensor for label-free detection of GPCR-mediated drug responses in personal cell lines. Biosens. Bioelectron. 74, 233-242 (2015).
  3. Atienzar, F. A., et al. The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery: defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models. J. Biomol. Screen. 16 (6), 575-587 (2011).
  4. Chen, H., et al. Label-free luminescent mesoporous silica nanoparticles for imaging and drug delivery. Theranostics. 3 (9), 650-657 (2013).
  5. Gao, Z., et al. Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA. Anal. Chem. 79 (9), 3291-3297 (2007).
  6. Giaever, I., Keese, C. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
  7. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Anal. Chem. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  8. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells. Anal. Chem. 74 (6), 1333-1339 (2002).
  9. Xing, J. Z., et al. Dynamic monitoring of cytotoxicity on microelectronic sensors. Chem. Res. Toxicol. 18 (2), 154-161 (2005).
  10. Abassi, Y. A., et al. Kinetic cell-based morphological screening: prediction of mechanism of compound action and off-target effects. Chem. Biol. 16 (7), 712-723 (2009).
  11. Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dent. Mater. 26 (1), 51-58 (2010).
  12. Atienza, J. M., Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. Dynamic monitoring of cell adhesion and spreading on microelectronic sensor arrays. J. Biomol. Screen. 10 (8), 795-805 (2005).
  13. Rahim, S., Uren, A. A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells. J. Vis. Exp. (50), e2792 (2011).
  14. Moodley, K., Angel, C. E., Glass, M., Graham, E. S. Real-time profiling of NK cell killing of human astrocytes using xCELLigence technology. J. Neurosci. Meth. 200 (2), 173-180 (2011).
  15. Marinova, Z., Walitza, S., Grunblatt, E. Real-time impedance-based cell analyzer as a tool to delineate molecular pathways involved in neurotoxicity and neuroprotection in a neuronal cell line. J. Vis. Exp. (90), e51748 (2014).
  16. Chatelier, R. C., Gengenbach, T. R., Griesser, H. J., Brighamburke, M., Oshannessy, D. J. A general method to recondition and reuse Biacore sensor chips fouled with covalently immobilized protein/peptide. Anal. Biochem. 229 (1), 112-118 (1995).
  17. Vashist, S. K. A method for regenerating gold surface for prolonged reuse of gold-coated surface plasmon resonance chip. Anal. Biochem. 423 (1), 23-25 (2012).
  18. Nguyen, T. T., et al. A regenerative label-free fiber optic sensor using surface plasmon resonance for clinical diagnosis of fibrinogen. Int. J. Nanomed. 10, 155-163 (2015).
  19. Xu, Z., et al. A general method to regenerate arrayed gold microelectrodes for label-free cell assay. Anal. Biochem. 516, 57-60 (2017).
  20. Wang, H., et al. Three-dimensionally controllable synthesis of multichannel silica nanotubes and their application as dual drug carriers. ChemPlusChem. 80 (11), 1615-1623 (2015).
  21. Verrier, S., Notingher, I., Polak, J. M., Hench, L. L. In situ monitoring of cell death using Raman microspectroscopy. Biopolymers. 74 (1-2), 157-162 (2004).
  22. Keighley, S. D., Li, P., Estrela, P., Migliorato, P. Optimization of DNA immobilization on gold electrodes for label-free detection by electrochemical impedance spectroscopy. Biosens. Bioelectron. 23 (8), 1291-1297 (2008).
  23. Kandimalla, V. B., et al. Regeneration of ethyl parathion antibodies for repeated use in immunosensor: a study on dissociation of antigens from antibodies. Biosens. Bioelectron. 20 (4), 903-906 (2004).
  24. McGovern, J. P., Shih, W. Y., Shih, W. H. In situ detection of Bacillus anthracis spores using fully submersible, self-exciting, self-sensing PMN-PT/Sn piezoelectric microcantilevers. Analyst. 132 (8), 777-783 (2007).
  25. Loo, L., et al. A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS). Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).
  26. Fischer, L. M., et al. Gold cleaning methods for electrochemical detection applications. Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).

Play Video

Cite This Article
Xu, Z., Song, Y., Jiang, H., Kong, Y., Li, X., Chen, J., Wu, Y. Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer. J. Vis. Exp. (133), e56250, doi:10.3791/56250 (2018).

View Video