وضع نموذج الإكلينيكية البشرية من أوستيوكلاستوجينيسيس من الدم المحيطية وحيدات مثقف يشترك مع خطوط خلايا سرطان الثدي
Summary
ويصف هذا البروتوكول وضع في المختبر البشري السريري نموذج من أوستيوكلاستوجينيسيس من الدم المحيطية وحيدات مثقف مع خطوط خلايا سرطان الثدي لمحاكاة التفاعل اوستيوكلاست خلايا السرطان. يمكن استخدام النموذج زيادة فهمنا لتكوين ورم خبيث العظام وتحسين الخيارات العلاجية.
Abstract
الحديث المتبادل بين الخلايا السرطانية وخلايا العظام في المكروية العظام أمر حاسم لفهم إليه تكوين ورم خبيث العظام. لقد طورنا في المختبر بشرية الكامل السريري نموذجا لثقافة المشارك من خلايا سرطان الثدي ووحيدات تمر التمايز تجاه الآكلة. نحن الأمثل نموذج أوستيوكلاستوجينيسيس بدءاً من عينة دم التي جمعت من الجهات المانحة صحية. أول مرة مفصولة بكثافة التدرج الطرد المركزي خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس)، والمصنف في كثافة عالية والمستحث للتمييز عن طريق إضافة اثنين من عوامل النمو (GFs): المنشط مستقبلات النووية عامل-κB يجند (رانكل) وبلعم عامل تحفيز مستعمرة (مكسف). الخلايا كانت تترك في الثقافة لمدة 14 يوما وثم الثابتة وتحليلها بواسطة تحليل المتلقين للمعلومات. في الانبثاث العظام عظمية، من آثار وصول خلية سرطان في العظام، تحريض أوستيوكلاستوجينيسيس. وبالتالي نحن تحدي نموذجنا مع الثقافات المشارك من خلايا سرطان الثدي لدراسة قوة تمايز الخلايا السرطانية فيما يتعلق بإحصاءات المالية الحكومية. طريقة مباشرة لدراسة سرطان خلايا اوستيوكلاست التفاعل لأداء الثقافات المشارك غير مباشر استناداً إلى استخدام مكيفة المتوسطة التي تم جمعها من الثقافات الخلية في سرطان الثدي ومختلطة مع متوسطة جديدة. ثم يستخدم هذا الخليط للحث على التمايز اوستيوكلاست. ونحن أيضا الأمثل طريقة مباشرة الثقافة المشارك فيها السرطان في الخلايا ووحيدات تمر التمايز تقاسم المتوسطة وتبادل يفرز عوامل. هذا تحسن كبير على أسلوب ثقافة المشاركة غير المباشرة الأصلية كما يمكن مراقبة التفاعلات المتبادلة لأنواع الخلايا اثنين الباحثين وإجراء تحليلات المتلقين للمعلومات لكل من خلايا السرطان والأكلة. هذا الأسلوب يتيح لنا لدراسة تأثير الأدوية على المكروية العظام المنتشر وخطوط الخلايا البذور غير تلك المستمدة من سرطان الثدي. يمكن أيضا استخدام النموذج لدراسة أمراض أخرى مثل هشاشة العظام أو غيره من الظروف العظام.
Introduction
العظم موقع مشترك لورم خبيث لأنواع مختلفة من الأورام الأولية مثل سرطان الثدي والبروستاتا، والرئة، مع 20-25% مرضى تطوير الانبثاث العظام أثناء المرض1،،من23. على وجه الخصوص، تحمل 70 في المائة مرضى سرطان الثدي دليل على عظم ورم خبيث في وفاة4. الورم والخلايا اللحمية التفاعل ضروري لتطور السرطان في سرطان الابتدائي والثانوي الآفات. في المكروية العظام، الانبثاث العظام عظمية من سرطان الثدي تعتمد على إنشاء دائرة مفرغة المرضية التي تحدث بين الخلايا السرطانية وخلايا العظام المكروية العظام. الخلايا السرطانية زعزعة التوازن العظام، وزيادة العظام ارتشاف5،،من67.
في الظروف العادية والمرضية، هي الآكلة الخلايا المسؤولة عن ارتشاف العظام، بينما خلايا الاوستيوبلاستس، في إيداع مصفوفة جديدة، المسؤولة عن تكوين العظام الجديدة8. وينظم نشاط اوستيوكلاست خلايا الاوستيوبلاستس من خلال التعبير عن رانكل، الذي تربط به مستقبلات مرتبة على سطح اوستيوكلاست قبل، حمل اوستيوكلاست قبل الانصهار، عملية ضرورية للتمايز في الآكلة ناضجة. ويزيد تحريض أوستيوكلاستوجينيسيس ارتشاف العظام. عدد كبير من الدراسات في فيفو تحسنت كثيرا أن فهمنا لعظم خبيث تشكيل9،،من1011. خلايا سرطان الثدي من الورم الرئيسي وفي المكروية العظام التشويش التوازن العظام، تعزيز أوستيوكلاستوجينيسيس والعظام ارتشاف8. في هذا السيناريو، يتم كل الجزيئية التفاعلات التي تحدث بين خلايا السرطان والأكلة ذات أهمية حاسمة. وكما سبق ذكره، وقد تم توضيح إليه تكوين ورم خبيث العظام في فيفو نماذج الفئران. ومع ذلك، بالإضافة إلى الحاجة إلى الموافقة على جميع في فيفو التجارب على الحيوانات “لجنة الأخلاقيات”، هناك عدة عيوب أخرى لإجراء تجارب في فيفو بما في ذلك ارتفاع التكاليف وتستغرق وقتاً طويلاً من أساليب. وقد تضافرت العديد من المؤلفين نماذج في الجسم الحي وفي المختبر الإكلينيكية من أوستيوكلاستوجينيسيس استخدام خط مورين من قبل الآكلة تسمى RAW246.79،،من1011. المآخذ على هذا الطراز تنبع من حقيقة أن الخلايا ملتزمون بالفعل لأن تصبح الآكلة قبل وليسوا من أصل الإنسان. لهذه الأسباب، البحوث متعدية الجنسيات يمكن أن تستفيد كثيرا من التوافر في المختبر البشرية الكامل نماذج الإكلينيكية لدراسة التفاعلات بين خلية سرطان العظام.
نحن الأمثل طريقة أوستيوكلاستوجينيسيس في المختبر بدءاً من عينات الدم المحيطي البشري12،13. وتستمد الآكلة وحيدات، التي موجودة، أن كان ذلك بدرجة صغيرة، في عينات الدم المحيطي. الخلايا وحيدات النوى مفصولة أولاً من الكريات الحمراء والمحببة في الدم كله بالتدرج فيكول الكثافة؛ ثم يتم اختيارهم بفضل قدرتها على الانضمام إلى الركازة البلاستيكية، خلافا للخلايا الليمفاوية. بعد البذر، تستزرع خلايا لمدة 14 يوما. مكسف ورانكل هي إحصاءات المالية الحكومية تتطلبها وحيدات التفريق أولاً إلى الضامة ثم إلى الآكلة14،15. مكسف المسبق لكامل مدة الفحص، بينما يستخدم رانكل لحفز عملية التمايز في المراحل المتأخرة من أوستيوكلاستوجينيسيس. في المرحلة المبكرة من التمايز، يساعد مكسف وحيدات تتكاثر والبقاء على قيد الحياة14،15. خلال الجزء الثاني من أوستيوكلاستوجينيسيس، خلايا تلتحم معا وناضجة الآكلة، لائحة توزيع مميزة “و الأكتين” في حلقات والإعراب عن علامات معينة مثل طرطرات مقاومة حمض الفوسفاتيز (TRAP) ومستقبلات كالسيتونين (الظهور) 14 , 15-يتكون لدينا طريقة من إضافة مكسف لثقافة الوحيدات الأيام السبعة الأولى من التجربة، ومزيج من مكسف ورانكل من 7 إلى 14 أيام. في نهاية هذه التجربة، هو تحليل أوستيوكلاستوجينيسيس بواسطة عد الخلايا المتمايزة، كما هو مفصل أدناه.
الثقافات الوحيدات التي يسببها للتفريق بإحصاءات المالية الحكومية تشكل الأساس لنموذجنا الإكلينيكية. نحن الأمثل نظام ثقافة المشارك دون إحصاءات المالية الحكومية فهم أفضل للسلطة أوستيوكلاستوجينيك من خلايا سرطان الثدي. قمنا بتطوير نموذج للثقافات المشاركة غير المباشرة أولاً بإضافة وسيلة (α 80%-“الحد الأدنى الأساسية المتوسطة” (α-الفنزويلية) ومتوسطة 20% مكيفة جمعت من ثقافة خلايا سرطان الثدي أن كانت حوالي 90% روافد للخلايا تمر بالتمايز12 . المتوسط مكيفة (لا تجمع تحت ظروف الحرمان المصل) جمعت بعد 24 ساعة ومختلطة مع متوسطة جديدة في نسبة من 1:4. المتوسطة مكيفة الناجمين عن التمايز اوستيوكلاست هامة فيما يتعلق بمراقبة سلبية. ومع ذلك، كما يتم فقدان المعلومات حول التفاعل المتبادل بين الخلايا السرطانية وخلايا العظام عند استخدام الثقافات المشاركة غير المباشرة، نحن تحسين نظامنا بالاضطلاع بالثقافات المشاركة المباشرة. نحن المصنف الخلايا السرطانية في 0.4 ميكرومتر بإدراج ووضعتهم في الآبار حيث كانت مطلي بالخلايا وحيدات النوى. باستخدام هذا الأسلوب، خلايا تتقاسم نفس المتوسط وتبادل البروتينات يفرزها. وهكذا أنشأنا نموذج الإكلينيكية بشرية الكامل من أوستيوكلاستوجينيسيس الناجمة عن سرطان خلايا13.
هذا النظام هو مرنة للغاية ويمكن استخدامها لأغراض بحثية مختلفة، مثلاً، في الدراسات الدوائية التحقيق في دور المخدرات في الانبثاث العظام. لدينا نموذج يجعل من الممكن لدراسة فعالية وآليات عمل العلاجات المستهدفة للعظام و/أو المخدرات انتيتومور في المكروية العظام وجود خلايا السرطان13. تصميم التجارب مع الضوابط الصحيحة، أي، خلايا السرطان والأكلة مثقف فردي، يسهل فهم تأثير الثقافة المشارك في نشاط المخدرات. ويصبح هذا النهج حتى أكثر إثارة للاهتمام عندما يستهدف المخدرات تجري دراسة كل سرطان خلايا والأكلة، مثلاً، افيروليموس16. يمكن أيضا استخدام هذا النموذج لتحديد مسارات جديدة للتفاعل بين الخلايا السرطانية وخلايا العظام.
Protocol
Representative Results
Discussion
الإكلينيكية في المختبر نماذج دراسة الآليات من الحديث المتبادل بين الخلايا السرطانية وخلايا العظام ضرورية لتحديد آليات لورم خبيث العظام التي يمكن استخدامها لإنشاء استراتيجيات علاجية جديدة. قمنا بتطوير نموذج الإنسان الكامل في المختبر من أوستيوكلاستوجينيسيس من الدم المحيطي الب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر كانغ احفورة لتوفير خط الخلية SCP2 ويرنا كريستيانو للمساعدة التحريرية.
Materials
| αMEM | Euroclone | BE12-169F | |
| Glutamine | Life-technologies | ECB3000D | |
| Fetal bovine serum | Life-technologies | ECS0180DPR | |
| hMCSF | Peprotech | 300-25 | Storage indications must be respected |
| hRANKL | Peprotech | 310-01 | Storage indications must be respected |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma Aldrich | 387 A | |
| Lymphocyte separation media | Biowest | L0560-100 | |
| Red Blood cell lysing buffer | SIgma | 11814389001 ROCHE |
|
| Trypsin | EuroClone | COD. ECB3052D | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | CRM-HTB-267 | |
| MCF7 | ATCC | HTB-22 | |
| Transwell | Corning | 3470-Clear | These inserts are for 24-well plates; 6.5 mm, 0.4 μM; pore size |
References
- Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. Bone and cancer: the osteoncology. Clin Cases Miner Bone Metab. 10 (2), 121-123 (2013).
- Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. Br J Cancer. 55 (1), 61-66 (1987).
- Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. A new emergency in oncology: bone metastases in breast cancer patients. Oncol Lett. 6 (2), 306-310 (2013).
- Swartz, M. A., et al. Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy. Cancer Res. 72 (10), 2473-2480 (2012).
- Roodman, G. D. Mechanisms of bone metastasis. N Eng J Med. 350 (12), 1655-1664 (2004).
- Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7 (11), 1285-1297 (2011).
- Chen, Y. C., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. Breast cancer metastasis to the bone: mechanisms of bone loss. Breast Cancer Res. 12 (6), 215 (2010).
- Guise, T. A. Breast cancer bone metastases: it’s all about the neighborhood. Cell. 154 (5), 957-959 (2013).
- Ell, B., et al. Tumor-induced osteoclast miRNA changes as regulators and biomarkers of osteolytic bonemetastasis. Cancer Cell. 24 (4), 542-556 (2013).
- Lu, X., et al. VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging α4β1-positive osteoclast progenitors. Cancer Cell. 20 (6), 701-714 (2011).
- Wang, H., et al. The osteogenic niche promotes early-stage bone colonization of disseminated breast cancer cells. Cancer Cell. 27 (2), 193-210 (2015).
- Liverani, C., et al. CSF-1 blockade impairs breast cancer osteoclastogenic potential in co-culture systems. Bone. 66, 214-222 (2014).
- Mercatali, L., et al. The effect of everolimus in an in vitro model of triple negative breast cancer and osteoclasts. Int J Mol Sci. 1 (11), e1827 (2016).
- Glantschnig, H., Fisher, J. E., Wesolowski, G., Rodan, G. A., Reszka, A. A. M-CSF, TNFalpha and RANK ligand promote osteoclast survival by signaling through mTOR/S6 kinase. Cell DeathDiffer. 10 (10), 1165-1177 (2003).
- Sugatani, T., Hruska, K. A. Akt1/Akt2 and mammalian target of rapamycin/Bim play critical roles in osteoclast differentiation and survival, respectively, whereas Akt is dispensable for cell survival in isolated osteoclast precursors. J Biol Chem. 280 (5), 3583-3589 (2005).
- Bertoldo, F., et al. Targeting bone metastatic cancer: role of the mTOR pathway. Biochim Biophys Acta. 1845 (2), 248-254 (2014).
- Kang, Y., Siegel, P. M., Shu, W., Drobnjak, M., Kakonen, S. M., Cordón-Cardo, C., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Simone, V., Ciavarella, S., Brunetti, O., Savonarola, A., Cives, M., Tucci, M. Everolimus restrains the paracrine pro-osteoclast activity of breast cancer cells. BMC Cancer. 14 (15), 692 (2015).
