מהדור ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זן בלי ג'ין שיבוט
Summary
אנו מתארים שיטה נתיישב, מהירה וזולה יחסית לדור של ג’ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זנים; טכניקה זו עשוי להיות מותאם לדור של ג’ין-שיבשו זנים של מינים שונים.
Abstract
שיטות טיפוסי הבהרה של הפונקציה של גן מסוים כרוך ניתוח השוואתי פנוטיפי של המתח פראי-סוג של זן אשר שיבשו את הגן עניין. מבנה ה-DNA ג’ין-הפרעה המכיל גן מרקר מתאים עמידות לאנטיביוטיקה היא שימושית לדור של ג’ין-שיבשו זנים של חיידקים. עם זאת, שיטות בנייה קונבנציונלית, אשר דורשים צעדים שיבוט גנטי, כרוכים פרוטוקולים מורכב ולגזול. כאן, מתוארת שיטה יחסית נתיישב, מהירה וחסכונית עבור ג’ין יישוב להפרעה mutans סטרפטוקוקוס . השיטה משתמשת 2-שלב פיוז ‘ ן תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) כדי ליצור את השיבוש לבנות ואת אלקטרופורציה לשינוי גנטי. שיטה זו אינה דורשת לתגובה אנזימטיות, מלבד PCR, ומציע בנוסף גמישות רבה יותר מבחינת העיצוב של הבונה שיבוש. העסקתם של אלקטרופורציה מקלה על ההכנה של תאים המוסמכת ומשפר את היעילות טרנספורמציה. השיטה הנוכחי עשוי להיות מותאם לדור של ג’ין-שיבשו זנים של מינים שונים.
Introduction
הפונקציה מפענוח כוללת בדרך כלל השוואה פנוטיפי בין זן פראי-סוג זן שבו גן מסוים של עניין יש נשענה. טכניקה זו ג’ין-הפרעה יש נעזרו ג’ין ניתוחים פונקציה במגוון רחב של taxa, מחיידקים יונקים. מבנה הגן-הפרעה הוא הכרחי עבור הדור של המתח שיבשו-גן; המבנה הזה, חומצה deoxyribonucleic (DNA) מורכב הגן סמן עמידות לאנטיביוטיקה דבוקה את ויוצאת איגוף מחוזות הגן היעד, הוא שולב הגנום באמצעות רקומבינציה הומולוגית. המתח שיבשו גנים עשויים להיות מבודדים באמצעות המדיה סלקטיבי המכילה האנטיביוטיקה. השיטה המקובלת המשמש לבנייה של המתח שיבשו ג’ין דורש צעדים מורכבים, כגון ההגברה של הגן היעד על ידי תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), מצדו של הגן לתוך פלסמיד מתאים, מערכת העיכול עם הגבלה אנזימים, religation להוסיף את הגן marker ההתנגדות לאנטיביוטיקה. תהליך זה הוא זמן רב, לוקח מספר ימים עד מספר שבועות, בהתאם להצלחת כל שלב. בנוסף, העיצוב של הפרעה בונה תלויה האתרים אנזים הגבלה של הגן היעד. כדי לפתור בעיות אלה, דווחו DNA מבוססי ה-PCR splicing שיטות1,2 על עיצוב האתר של ג’ין שיבשו מוטציות של Dictyostelium discoideum3 ו- Synechocystis sp. PCC68034 . במחקר הנוכחי, פותחה שיטה ליצור זן streptococcal משובשות ג’ין בצורה מהירה יחסית, נתיישב, וזולה, ניצול שיטה מבוססת-PCR ששונתה (איזור 2-שלב פיוז ‘ ן PCR) לבנייה של ההפרעה לבנות, אלקטרופורציה לשינוי גנטי.
היתוך גרעיני 2-שלב שה-PCR דורש דנ א גנומי, הגן סמן עמידות לאנטיביוטיקה כתבנית PCR ו- 4 זוגות כראוי מעוצב לנוקלאוטידים. בשלב הראשון (1סנט PCR), אזור במעלה 1-kb איגוף של הגן היעד, אזור במורד הזרם 1-kb איגוף של היעד ג’ין, הגן marker ההתנגדות לאנטיביוטיקה הם מוגבר על ידי ה-PCR. 5′ אזורים ומהצמיגים הפוכה והן את קדימה למתחילים, הגברה של במעלה הזרם, במורד הזרם איגוף אזורים, בהתאמה, כוללים משלים הקצוות של הגן סמן 15 בסיסים. 5′ אזורים ויוצאים צבעי יסוד סמן גנטי הגברה באופן דומה לכלול 15 בסיסים משלימים לקצה התחתון של האזור איגוף במעלה הזרם של הגן היעד, בקצה העליון של האזור איגוף במורד הזרם של הגן היעד, בהתאמה. לכן, שברי מוגבר שלושה מכילים אזורים חופפים זוג 30-בסיסים באתר פיוז’ן. בשלב השני (2nd PCR), PCR מבוצע עם תחל PCR מקוננות באמצעות שלושה שברי מוגבר על ידי 1סנט PCR כתבניות. האזורים משלימים תבניות בנוסף מקושרים אחד לשני באמצעות 2nd PCR. לבסוף, הבונה על רקומבינציה הומולוגית הוא הכיר את המתח פראי-סוג מאת אלקטרופורציה. ניתן לבירור שיבוש גנטי מוצלחת על ידי ה-PCR באמצעות תחל ספציפיים. למרות הבונה הפרעה מוגבר באמצעות אמינות גבוהה DNA פולימראז, תגובות אנזימטיות נוספים, כגון ה-DNA מצדו או עיכול דנ א, אינם הכרחיים ליצירת הבונה. בנוסף, אזור שנמחקו או משומר על הגנום יכול לבחור בגמישות על פי עיצוב פריימר.
בשנת העבודה הנוכחית, בוצעה מחיקה של כל האזור קידוד של הגן gtfC , שמקודד glucosyltransferase ב mutans סטרפטוקוקוס, כדי להדגים את שיטת שיבוש גנטי מהיר, קל זן streptococcal. בנוסף, gtfB-זן שיבשו נוצר באופן זהה. Glucosyltransferases מקודד על ידי הן gtfC והן gtfB לתרום cariogenic שיניים biofilm פיתוח5,6. היכולות להיוות biofilm הפראי-סוג זן (ס’ mutans WT), gtfC-הפרעת המתח (Δס mutans gtfC), gtfB-זן שיבשו (Δס mutans gtfB) הוערכו עבור ניתוחים פנוטיפי השוואתי. פרוטוקול זה מרחיב את היישום של שיטה שני שלבים של הפרעה גן זן נוסף, עשוי להיות שונה עבור מחקרים של ג’ין פונקציה במגוון רחב יותר של taxa.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול הנוכחי, יש לתכנן את צבעי יסוד 1סנט PCR כדי להגביר כ 1 kb במעלה הזרם, במורד הזרם איגוף אזורים של אזור היעד הגנום. רצפי זמן איגוף כאלה נחוצים לשפר את היעילות של רקומבינציה הומולוגית.
מסדרות תחל (היפוך למעלה, למטה-קדימה, spcr-קדימה, ו- spcr-הפוך) בפרוט…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי החברה יפן הקידום של המדע [מספרים גרנט 16 K 15860 אל ט. מ ו- 15 K 15777 כדי N.H.].
Materials
| Streptococus mutans | Stock strain in the lab. | Wild-type strain (Strain UA159) | |
| Genomic DNA extraction kit | Zymo Research | D6005 | |
| Bead-beating disruption apparatus | Taitec | GM-01 | |
| Synthetic genes | Eurofins Genomics | Custom-ordered | Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene |
| Thermal cycler | Astec | PC-708 | |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | 35 bases in length |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 | |
| Electroporator | Bio-rad | 1652100 | |
| Electroporation cuvette | Bio-rad | 1652086 | 0.2-cm gap |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture media |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics |
| Erythromycin | Wako | 057-07151 | Antibiotics |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
References
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Kuwayama, H., et al. PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors. Nucleic Acids Res. 30 (2), E2 (2002).
- Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II. Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).
- Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis. Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis. Gene. 19 (3), 345-353 (1982).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. J Vis Exp. (69), (2012).
