遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌緊張せず遺伝子クローニングの生成
Summary
遺伝子破壊ミュータンス連鎖球菌の世代の簡易・迅速かつ比較的安価な手法について述べる株;この手法は、様々 な種の遺伝子破壊系統の世代の適応可能性があります。
Abstract
特定遺伝子の機能解明のための典型的な方法は、野生型株および興味の遺伝子が崩壊したひずみの比較の表現型解析を含みます。適切な抗生物質耐性マーカー遺伝子を含む遺伝子破壊 DNA コンストラクトは細菌の遺伝子破壊株の生成に役立ちます。しかし、遺伝子クローンの手順を必要とする従来の工法は、複雑で時間のかかるプロトコルを伴います。ここでは、比較的簡易、迅速かつコスト効果の高いミュータンス連鎖球菌の遺伝子破壊法を説明します。2 段階核融合ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 中断構築および形質転換をエレクトロポレーションを生成する方式します。このメソッドは、PCR 以外の酵素反応を必要としませんし、また中断構築のデザインの面での柔軟性を提供しています。エレクトロポレーションの雇用は有能なセルの準備を容易に、変換効率を向上します。本法は、様々 な種の遺伝子破壊系統の世代の適応可能性があります。
Introduction
遺伝子機能解析は通常興味の特定の遺伝子が崩壊したひずみと野生型株の表現型の比較を行います。この遺伝子破壊法は、イチイ、哺乳類に細菌からの広い範囲で遺伝子機能解析のために利用されています。遺伝子破壊ひずみ; の生成に必要な遺伝子破壊コンストラクトとはこのデオキシリボ核酸 (DNA) の構築は上流と下流の並ぶターゲット遺伝子の領域を融合した抗生物質耐性マーカー遺伝子から成り、相同組換えによってゲノムに組み込まれています。遺伝子破壊ひずみは、抗生物質を含んでいる選択的なメディアを使用して分離することが。遺伝子破壊株の建設に使用される従来の方法ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)、適切なプラスミドの制限の消化に遺伝子の結紮によるターゲット遺伝子の増幅などの複雑な手順が必要酵素、および抗生物質耐性マーカー遺伝子を挿入する桿菌。このプロセスは時間がかかり、各ステップの成功に応じて、数週間に数日を取るです。さらに、混乱の構造のデザインはターゲット遺伝子の制限酵素サイトに依存です。これらの問題を解決するには DNA の PCR によるスプライシング方法1,2遺伝子破壊変異体キイロタマホコリカビ3と阻害の sp PCC68034のデザインが報告されています。本研究では混乱の建設のため (融合 2 ステップ PCR を指定) 変更された PCR ベース法を活用、比較的簡易、迅速かつ安価な方法で遺伝子破壊の連鎖球菌株を生成する方法を開発しました。構築および形質転換をエレクトロポレーション。
PCR ゲノム DNA、抗生物質耐性マーカー遺伝子 PCR のテンプレートとして、4 つのペアを適切に必要な 2 段階核融合には、オリゴヌクレオチドのプライマーが設計されています。最初のステップ (1st PCR)、ターゲット遺伝子、ターゲット 1 kb の並ぶ下流域の 1 kb の並ぶ上流域と抗生物質耐性マーカー遺伝子は PCR によって増幅されます。逆のプライマーの前方のプライマーは、増幅の上流と下流の 5′ 領域には並ぶ領域、それぞれ、15 拠点マーカー遺伝子の両端に相補的なが含まれます。マーカー遺伝子増幅の前方および逆のプライマーの 5′ 領域は同様に 15 拠点の標的遺伝子の上流の並ぶ領域の下端およびターゲット遺伝子の下流の並ぶ領域の上部の端に補足を含めるそれぞれ。したがって、3 つの増幅されたフラグメントは融合サイトで重複する 30 塩基対の領域を含みます。2 番目のステップ (2nd PCR)、1st PCR テンプレートとしてによって増幅される 3 つの断片を使用して入れ子になった、PCR のプライマーと PCR が行われます。テンプレートの相補的な領域はさらに、2nd PCR によって互いにリンクされます。最後に、相同組換えの構造は、電気穿孔法による野生型株に導入です。成功した遺伝子破壊は、特異的プライマーを用いた PCR による検証可能性があります。中断構築は高忠実度 DNA ポリメラーゼを使用して増幅される DNA の ligation または DNA 消化など、追加の酵素反応は構成要素を生成する必要ありません。さらに、ゲノム上の削除または保存領域はプライマー デザインに応じて柔軟に選択されるかもしれない。
現在の仕事では、連鎖球菌種の迅速で簡単な遺伝子の中断方法を示すことミュータンス連鎖球菌グルコシルトランスフェラーゼをエンコード、 gtfC遺伝子のコーディングの地域の全体の削除を行った。さらに、 gtfB-破壊ひずみは、同じ方法で生成されました。GtfCとgtfBの両方でエンコードされた花色は、齲蝕原性歯科バイオ フィルム開発5,6に貢献します。野生型のバイオ フィルム形成能力ひずみ (s.mutans WT) gtfC-ひずみ (, S. mutans ΔgtfC)、およびgtfBを中断-中断ひずみ (, S. mutans ΔgtfB) を評価しました。比較の表現型解析。このプロトコルは、追加種に遺伝子破壊の二段階法のアプリケーションを拡張し、幅広い分類群の遺伝子機能の研究の変更可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
現在のプロトコルの上流と下流の並ぶゲノムのターゲット領域の領域に約 1 kb を増幅する 1st PCR のためのプライマーを設計されなければなりません。このような長い並ぶシーケンスは相同組換えの効率を改善する必要があります。
プライマーのシーケンス (逆アップ、ダウン-フォワード、 spcr-前方、およびspcr-逆) このプロトコルで?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、[許可番号 16 K 15860 へ曲がらなければなりません、15 K 15777 ニューハンプシャー] 学術振興会によって支えられました。
Materials
| Streptococus mutans | Stock strain in the lab. | Wild-type strain (Strain UA159) | |
| Genomic DNA extraction kit | Zymo Research | D6005 | |
| Bead-beating disruption apparatus | Taitec | GM-01 | |
| Synthetic genes | Eurofins Genomics | Custom-ordered | Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene |
| Thermal cycler | Astec | PC-708 | |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | 35 bases in length |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 | |
| Electroporator | Bio-rad | 1652100 | |
| Electroporation cuvette | Bio-rad | 1652086 | 0.2-cm gap |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture media |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics |
| Erythromycin | Wako | 057-07151 | Antibiotics |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
References
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