جيل تعطيل الجينات العقدية mutans سلالة دون الجيني الاستنساخ
Summary
يصف لنا طريقة سهلة وسريعة وغير مكلفة نسبيا لتوليد الجينات تعطل العقدية mutans سلالات؛ قد يكون هذا الأسلوب تكييف لتوليد سلالات تعطل الجينات من مختلف الأنواع.
Abstract
أساليب نموذجية لتوضيح وظيفة الجينات خاصة تشمل التحليلات المقارنة المظهرية من سلالة البرية من نوع وسلالة التي تعطلت في الجينات للفائدة. بنية الحمض النووي تعطيل جينات التي تحتوي على جينات مقاومة للمضادات الحيوية مناسبة علامة مفيد لتوليد سلالات تعطلت الجين في البكتيريا. ومع ذلك، أساليب البناء التقليدية، التي تتطلب خطوات استنساخ الجينات، تنطوي على بروتوكولات معقدة وتستغرق وقتاً طويلاً. هنا، يتم وصف طريقة سهلة نسبيا وسريعة، وفعالة من حيث التكلفة لتعطيل الجينات المستهدفة في mutans العقدية . ويستخدم الأسلوب انصهار 2-الخطوة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتوليد بنية التعطيل وانهانسر للتحول الوراثي. هذا الأسلوب لا يتطلب فعل الانزيمية، عدا بكر، بالإضافة إلى ذلك يوفر مرونة أكبر فيما يتعلق بتصميم بنية التعطيل. توظيف انهانسر يسهل إعداد الخلايا المختصة ويحسن كفاءة التحويل. الأسلوب الحالي قد تكون مناسبة لتوليد سلالات تعطل الجينات من مختلف الأنواع.
Introduction
عادة ما ينطوي على تحليل وظيفة الجينات مقارنة المظهرية بين سلالة البرية من نوع وسلالة قد تعطلت فيها جين معين للفائدة. وقد استخدمت هذا الأسلوب تعطيل الجينات لتحليلات وظيفة الجينات في مجموعة واسعة من الأصناف، من البكتيريا إلى الثدييات. بناء جينات تعطل ضروري لتوليد سلالة تعطل الجينات؛ هذا بنية الحمض الخلوي الصبغي (DNA) يتكون من الجينات المقاومة للمضادات الحيوية علامة تنصهر إلى المنبع والمصب المرافقة مناطق الجينات المستهدفة، وأدمجت في الجينوم عن طريق جزئ مثلى. قد يكون سلالة تعطل الجينات المعزولة باستخدام وسائل الإعلام الانتقائي التي تحتوي على المضادات الحيوية. الطريقة التقليدية المستخدمة في تشييد سلالة الجينات تعطل يتطلب خطوات معقدة، مثل تضخيم الجينات المستهدفة بتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، ربط الجين في بلازميد مناسبة، الهضم مع تقييد الإنزيمات، وريليجيشن لإدراج الجين علامة مقاومة المضادات الحيوية. هذه العملية مضيعة للوقت، أخذ عدة أيام إلى عدة أسابيع، اعتماداً على نجاح كل خطوة. وبالإضافة إلى ذلك، تصميم بنيات تعطيل اعتماداً على مواقع إنزيم التقييد للجينات المستهدفة. لحل هذه المشكلات، أبلغ عن الحمض النووي القائم على بكر الربط أساليب1،2 لتصميم طفرات الجينات تعطل ديسكويديوم ديكتيوستيليوم3 وسينيتشوسيستيس sp. PCC68034 . في هذه الدراسة، تم تطوير أسلوب لتوليد سلالة العقدية تعطل الجينات بطريقة سريعة، وسهلة، وغير مكلفة نسبيا، استخدام أسلوب المستندة إلى بكر معدلة (عين 2-الخطوة الانصهار PCR) لتشييد تعطل بناء وانهانسر للتحول الوراثي.
2-الخطوة الانصهار يتطلب PCR الحمض النووي والجينات المقاومة للمضادات الحيوية علامة كقالب PCR، وأربعة أزواج من الأنسب المصممة اليغنوكليوتيد كبسولة تفجير. في الخطوة الأولى (1st PCR)، منطقة ترافقه المنبع 1 كيلوبايت من الجينات المستهدفة، منطقة ترافقه المصب كيلو بايت-1 الهدف تتضخم الجينات، والجين علامة مقاومة المضادات الحيوية ببكر. المناطق 5 ‘ عكس التمهيدي والتمهيدي إلى الأمام، للتضخيم من المنبع والمصب المرافقة المناطق، على التوالي، تشمل 15 قواعد مكملة لنهايات الجين ماركر. وبالمثل تتضمن 5 ‘ مناطق الإشعال على حد سواء إلى الأمام أو عكس للتضخيم الجيني علامة 15 قواعد مكملة للنهاية السفلي لمنطقة ترافقه المنبع الجينات المستهدفة والحد الأعلى لمنطقة ترافقه المصب من الجينات المستهدفة، على التوالي. ولذلك تتضمن ثلاث شظايا تضخيم متراكبتين زوج 30-قاعدة في موقع الانصهار. في الخطوة الثانية (2nd PCR)، يتم إجراء PCR مع الإشعال PCR متداخلة باستخدام الأجزاء الثلاثة تضخيمه قبل 1st PCR كقوالب. بالإضافة إلى ذلك ترتبط المناطق مكملة للقوالب ببعضهما البعض عبر 2nd PCR. وأخيراً، البناء جزئ مثلى هو عرض لسلالة البرية من نوع انهانسر. من الممكن التحقق من اضطراب الجينات الناجحة PCR باستخدام كبسولة تفجير محددة. على الرغم من أن يتم تضخيمه في بناء تعطيل استخدام عالية الدقة بوليميريز الحمض النووي، التفاعلات الانزيمية إضافية، مثل ربط الحمض النووي أو الهضم الحمض النووي، وليست ضرورية لتوليد بنية. وبالإضافة إلى ذلك، قد اختار منطقة المحذوفة أو المحافظة على الجينوم مرونة وفقا للتصميم التمهيدي.
في هذا العمل، أجرى الحذف للمنطقة بأسرها ترميز الجينات جتفك ، الذي يقوم بترميز جلوكوسيلترانسفيراسي في mutans العقدية، لإظهار طريقة تعطيل الجينات سريعة وسهلة في أنواع العقدية. بالإضافة إلى ذلك، جتفب-ولدت ضغطاً تعطلت بنفس الطريقة. تسهم جلوكوسيلترانسفيراسيس المشفرة بواسطة جتفك و جتفب كاريوجينيك بيوفيلم الأسنان التنمية5،6. قدرات تشكيل بيوفيلم البرية-النوع سلالة (S. mutans WT)، جتفك-عطلت السلالة (ΔS. mutans جتفك)، وجتفب-قيمت سلالة تعطل (S. mutans Δجتفب) لتحليل مقارن المظهرية. هذا البروتوكول يمتد تطبيق أسلوب خطوتين لتعطيل الجينات أنواع إضافية ويمكن تعديله للدراسات المتعلقة بوظيفة الجينات في مجموعة واسعة من الأصناف.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، يجب أن تصمم الإشعال ل 1st PCR لتضخيم حوالي 1 كيلوبايت من المنبع والمصب المرافقة مناطق المنطقة المستهدفة في الجينوم. تسلسلات طويلة ترافقه هذه ضرورية لتحسين كفاءة جزئ مثلى.
تسلسل الإشعال (عكس أعلى، لأسفل إلى الأمام، توافق آراء ساو باولوr-إلى ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل “الجمعية اليابانية” “تعزيز العلوم” [أرقام المنح 16 ك 15860 على الخرائط و 15 ك 15777 إلى N.H.].
Materials
| Streptococus mutans | Stock strain in the lab. | Wild-type strain (Strain UA159) | |
| Genomic DNA extraction kit | Zymo Research | D6005 | |
| Bead-beating disruption apparatus | Taitec | GM-01 | |
| Synthetic genes | Eurofins Genomics | Custom-ordered | Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene |
| Thermal cycler | Astec | PC-708 | |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | 35 bases in length |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 | |
| Electroporator | Bio-rad | 1652100 | |
| Electroporation cuvette | Bio-rad | 1652086 | 0.2-cm gap |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture media |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics |
| Erythromycin | Wako | 057-07151 | Antibiotics |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
References
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Kuwayama, H., et al. PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors. Nucleic Acids Res. 30 (2), E2 (2002).
- Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II. Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).
- Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis. Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis. Gene. 19 (3), 345-353 (1982).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. J Vis Exp. (69), (2012).
