Generation af en gen-forstyrret Streptococcus mutans stamme uden Gene kloning

Summary

Vi beskriver en letkøbt, hurtig og relativt billig metode for generation af gen-forstyrret Streptococcus mutans stammer; denne teknik kan tilpasses til generation af gen-forstyrret stammer af forskellige arter.

Abstract

Typiske metoder til udredning af funktionen af et bestemt gen indebærer sammenlignende fænotypiske analyser af wild-type belastning og en stamme, hvor gen af interesse har været forstyrret. En gen-forstyrrelser DNA konstruktion der indeholder en egnet antibiotikaresistens-markørgen er nyttige for generation af gen-forstyrret stammer i bakterier. Men konventionelle byggemetoder, der kræver gen kloning trin, involverer komplekse og tidskrævende protokoller. Her, er en relativt letkøbt, hurtig og omkostningseffektiv metode til målrettede gen forstyrrelser i Streptococcus mutans beskrevet. Metoden udnytter en 2-trins fusion Polymerasekædereaktionen (PCR) til at generere forstyrrelser konstruktion og elektroporation for genetiske transformation. Denne metode kræver ikke en enzymatisk reaktion, end PCR, og giver desuden større fleksibilitet med hensyn til udformningen af forstyrrelser konstruktion. Beskæftigelse af elektroporation letter udarbejdelsen af kompetente celler og forbedrer transformation effektivitet. Den nuværende metode kan tilpasses til generation af gen-forstyrret stammer af forskellige arter.

Introduction

Gen funktion analyse involverer typisk en fænotypiske sammenligning mellem en vildtype stamme og en stamme, hvor et bestemt gen af interesse har været forstyrret. Dette gen-forstyrrelser teknik er blevet udnyttet til gen funktion analyser i en bred vifte af taxa, fra bakterier til pattedyr. En gen-forstyrrelser konstruktion er nødvendige for generation af gen-afbrød stammen; denne deoxyribonukleinsyre (DNA) konstruktion består af antibiotikaresistens-markørgen sammenvokset til upstream og downstream flankerende regioner af target-genet, og er indarbejdet i genom via homologe rekombination. Gen-afbrød stammen kan isoleres ved hjælp af selektivt medie, der indeholder antibiotika. Den konventionelle metode anvendes til opførelse af gen-afbrød stammen kræver komplekse trin, som forstærkning af target-genet ved polymerase kæde reaktion (PCR), ligatur af genet ind i en passende plasmid, fordøjelse med begrænsning enzymer, og religation til at indsætte antibiotika-resistens markørgen. Denne proces er tidskrævende, tager flere dage til flere uger, afhængigt af succesen af hvert trin. Desuden, er udformningen af forstyrrelser konstruktioner afhængig af begrænsning enzym websteder af target-genet. For at løse disse problemer, er blevet rapporteret PCR-baseret DNA splejsning metoder^1,2 for udformningen af gen-forstyrret mutanter af Dictyostelium discoideum³ og Synechocystis sp. PCC6803⁴ . I den nuværende undersøgelse, blev udviklet en metode til at generere en gen-forstyrret streptokok stamme i en relativt hurtig, letkøbt og billig måde, udnytter en modificeret PCR-baseret metode (udpeget 2-trins fusion PCR) for opførelsen af forstyrrelsen konstruere og elektroporation for genetiske transformation.

2-trins fusion PCR kræver genomisk DNA, antibiotikaresistens-markørgen som PCR skabelon og fire par korrekt designet oligonukleotid primere. I det første trin (1^st PCR), en 1-kb opstrøms flankerende region af target-genet, en 1-kb downstream flankerende region af målet forstærkes-genet, og antibiotika-resistens markørgen ved PCR. 5′ regionerne i både de omvendte primer og den fremad primer, til forstærkning af upstream og downstream omfatter flankerende regioner, henholdsvis, 15 baser supplement til enderne af markørgen. 5′ regionerne i både forward og reverse primere for markør gen amplifikation ligeledes omfatte 15 baser supplement til den nederste ende af upstream flankerende regionen af target-genet og den øverste ende af den downstream flankerende region af genet mål henholdsvis. Derfor, de tre forstærket fragmenter indeholder overlappende 30-basepar områder på webstedet fusion. I det andet trin (2^nd PCR) udføres PCR med indlejrede PCR primere ved hjælp af de tre fragmenter forstærkes af de 1^st PCR som skabeloner. De supplerende regioner af skabelonerne er desuden forbundet med hinanden via den 2^nd PCR. Endelig, konstruere for homologe rekombination er introduceret til vildtype stamme af elektroporation. Vellykket gen forstyrrelser kan bekræftes ved PCR ved hjælp af specifikke primere. Selv om afbrydelse konstruktionen forstærkes ved hjælp af high-fidelity DNA polymerase, er yderligere enzymatiske reaktioner, såsom DNA ligatur eller DNA fordøjelsen, ikke nødvendige for at generere konstruktionen. Derudover kan en slettede eller konserverede region på genomet vælges fleksibelt efter primer design.

I den nuværende arbejde, blev sletning af den hele kodende region af gtfC -genet, som koder glucosyltransferase i Streptococcus mutans, udført for at påvise hurtig og nem gen forstyrrelser metode i en streptokok arter. Derudover en gtfB-forstyrret stamme blev genereret på samme måde. Glucosyltransferases kodet af både gtfC og gtfB bidrage til kariogene dental biofilm udvikling^5,6. Wild-type biofilm-dannende evner stamme (S. mutans WT), gtfC-forstyrret stamme (S. mutans ΔgtfC) og gtfB-forstyrret stamme (S. mutans ΔgtfB) blev evalueret for sammenlignende fænotypiske analyser. Denne protokol udvider anvendelsen af en to-trins metode til gen afbrydelse af en yderligere arter og kan ændres til undersøgelser af genfunktioner i en bredere vifte af taxa.

Protocol

1. primer Design forberede 2-trins fusion PCR og verifikation af genet forstyrrelser primere. Bemærk: Tabel 1 viser de primer sekvenser bruges i denne protokol. figur 1 viser et skematisk illustration af 2-trins fusion PCR-metoden bruges til at generere S. mutans Δ gtfC. Design primere for udskiftning af målområde i genom med spectinomycin-resistens gen (spc r) 7. …

Representative Results

Figur 2 viser, at størrelsen af hvert produkt fra den 1st PCR, som observeres på 1%-agarosegel, var i god aftale med den forventede størrelse af ca. 1 kb. Figur 3 viser den gel elektroforese analyse af produkter fra de 2nd PCR. Figur 4 viser S. mutans kolonier omdannet med forstyrrelser konstruktion, og en gel elektroforese analyse af kolonien PCR produkter. Amplikon…

Discussion

I denne protokol, skal primere for 1^st PCR være konstrueret til at forstærke ca 1 kb opstrøms og nedstrøms flankerende regioner i målområde i genomet. Sådanne lange flankerende sekvenser er nødvendige for at forbedre effektiviteten af homologe rekombination.

Sekvenser af primere (op-reverse, nede-forward, spc^Rasmussen-fremad og spc^Rasmussen-omvendt) i denne protokol blev automatisk bestemmes baseret på webstedet af indarbejdelse af fo…

Materials

Streptococus mutans	Stock strain in the lab.		Wild-type strain (Strain UA159)
Genomic DNA extraction kit	Zymo Research	D6005
Bead-beating disruption apparatus	Taitec	GM-01
Synthetic genes	Eurofins Genomics	Custom-ordered	Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene
Thermal cycler	Astec	PC-708
PCR primers	Eurofins Genomics	Custom-ordered	35 bases in length
DNA polymerase	Takara	R045A	High-fidelity DNA polymerase
Gel extraction kit	Nippon Genetics	FG-91202	DNA extraction from agarose gel
Gel band cutter	Nippon Genetics	FG-830
Spectrophotometer	Beckman Coulter	DU 800
Electroporator	Bio-rad	1652100
Electroporation cuvette	Bio-rad	1652086	0.2-cm gap
Anaeropack	Mitsubishi Gas Chemical	A-03	Anaerobic culture system
Brain heart infusion broth	Becton, Dickinson	237500	Bacterial culture media
Spectinomycin	Wako	195-11531	Antibiotics
Erythromycin	Wako	057-07151	Antibiotics
Sucrose	Wako	196-00015	For biofilm development
CBB R-250	Wako	031-17922	For biofilm staining