Generatie van een gen-verstoord Streptococcus mutans stam zonder Gene klonen
Summary
We beschrijven een facile, snelle en relatief goedkope methode voor het genereren van gen-verstoord Streptococcus mutans stammen; Deze techniek kan worden aangepast voor de generatie van gen-verstoord stammen van verschillende diersoorten.
Abstract
Typische methodes voor de opheldering van de functie van een bepaald gen omvatten vergelijkende fenotypische analyses van de wild-type stam en een stam die het gen van belang heeft is verstoord. Een gen-verstoring DNA constructie met een geschikt antibioticaresistentie marker-gen is nuttig voor de generatie van gen-verstoord stammen van bacteriën. Conventionele bouwwijze, waarvoor gene klonen stappen, betrekken echter ingewikkeld en tijdrovend protocollen. Hier, wordt een relatief facile, snelle en kosteneffectieve methode voor gerichte gene verstoring in Streptococcus mutans beschreven. De methode maakt gebruik van een 2-step fusion polymerase-kettingreactie (PCR) om de verstoring van de constructie en electroporation voor genetische transformatie te genereren. Deze methode vereist geen een enzymatische reactie, dan PCR, en bovendien biedt meer flexibiliteit in termen van het ontwerp van de verstoring van de constructie. Werkgelegenheid van electroporation vergemakkelijkt het opstellen van bevoegde cellen en verbetert de efficiency van de transformatie. De huidige methode kan worden aangepast voor de generatie van gen-verstoord stammen van verschillende diersoorten.
Introduction
Gene functie analyse betekent meestal dat een fenotypische vergelijking tussen een wild-type stam en een stam die een bepaald gen van belang heeft is verstoord. Deze verstoring van de gen techniek is gebruikt voor gene functie analyses in een breed scala van taxa, van bacteriën tot zoogdieren. De constructie van een gen-verstoring is noodzakelijk voor de generatie van de gen-verstoord stam; Deze constructie deoxyribonucleic acid (DNA) bestaat uit de antibioticaresistentie marker gene gesmolten aan de upstream- en downstream flankerende gebieden van het target-gen, en is opgenomen in het genoom via homologe recombinatie. De stam van gen-verstoord kan worden geïsoleerd met behulp van selectieve media met het antibioticum. De conventionele methode gebruikt voor de bouw van de gen-verstoord stam vereist complexe stappen, zoals de versterking van het target-gen door de polymerase-kettingreactie (PCR), Afbinding van het gen in een geschikte plasmide, spijsvertering met beperking enzymen en regeling te voegen van het antibioticum-resistentie marker-gen. Dit proces is tijdrovend, het nemen van enkele dagen tot enkele weken, afhankelijk van het succes van elke stap. Het ontwerp van verstoring constructies is bovendien afhankelijk van de restrictie-enzym-sites van de target-gen. U kunt deze problemen oplossen, zijn PCR-gebaseerde DNA splicing methoden1,2 voor het ontwerp van gen-verstoord mutanten van Dictyostelium discoideum3 en Synechocystis sp. PCC68034 gemeld. In de huidige studie, een methode ontwikkeld voor het genereren van een gen-verstoord streptokokken stam in een relatief snelle, facile en goedkope manier, gebruik makend van een gemodificeerde PCR-gebaseerde methode (aangewezen 2-step fusion PCR) voor de bouw van de verstoring Construct en electroporation voor genetische transformatie.
De fusie van de 2-step die PCR genomic DNA, de resistentie tegen antibiotica marker gene als een PCR-sjabloon en vier paar op de juiste wijze vereist ontworpen oligonucleotide inleidingen. In de eerste stap (1st PCR), een 1-kb upstream begeleidende regio van het target-gen, een stroomafwaartse begeleidende regio 1-kb van het doel worden-gen, en het antibioticum-resistentie marker-gen versterkt door PCR. De 5′ regio’s zowel de omgekeerde primer en de voorwaartse primer, voor versterking van de upstream en downstream bevatten flankerende gebieden, respectievelijk 15 honken complementair aan de uiteinden van het marker-gen. De 5′ regio’s zowel voorwaartse als terugwaartse inleidingen voor marker gene amplificatie omvatten ook 15 honken complementair aan het ondereinde van de upstream begeleidende regio van het target-gen en de bovenkant van de stroomafwaartse begeleidende regio van het target-gen, respectievelijk. Dus bevatten de drie versterkte fragmenten overlappende 30-basenpaar regio’s op de site van de fusie. In de tweede stap (2nd PCR), wordt PCR uitgevoerd met genestelde PCR inleidingen met behulp van de drie fragmenten versterkt door de 1st PCR als sjablonen. De complementaire regio’s van de sjablonen zijn bovendien aan elkaar gekoppeld via de 2nd PCR. Tot slot, de constructie voor homologe recombinatie is geïntroduceerd in de stam van de wild-type door electroporation. Verstoring van de succesvolle gen kan worden geverifieerd door PCR met behulp van specifieke primers. Hoewel de structuur van de verstoring wordt versterkt met behulp van HiFi-polymerase van DNA, zijn extra enzymatische reacties, zoals DNA afbinding of spijsvertering van DNA, niet nodig voor het genereren van de constructie. Daarnaast kan een verwijderde of geconserveerde regio op het genoom flexibel worden gekozen volgens primer ontwerp.
In het huidige werk, werd verwijdering van de gehele codering regio van het gtfC -gen, dat glucosyltransferase in Streptococcus mutans codeert, uitgevoerd om aan te tonen van de snelle, gemakkelijke gene verstoring methode in een streptokokken soorten. Bovendien, een gtfB-verstoord stam was gegenereerd op dezelfde manier. De glucosyltransferases die zijn gecodeerd door zowel de gtfC als de gtfB bijdragen tot verwekkende tandheelkundige biofilm ontwikkeling5,6. De biofilm-vormende capaciteiten van het wild-type stam (S. mutans WT), gtfC-verstoord stam (S. mutans ΔgtfC), en gtfB-verstoord stam (S. mutans ΔgtfB) werden geëvalueerd voor vergelijkende fenotypische analyses. Dit protocol de toepassing van een methode in twee stappen voor de verstoring van het gen voor een extra vissoort wordt uitgebreid en kan worden gewijzigd voor studies van de genfunctie in een breder scala van taxa.
Protocol
Representative Results
Discussion
In het huidige protocol, moeten de inleidingen voor de 1st PCR worden ontworpen om het versterken van ongeveer 1 kb stroomopwaarts en stroomafwaarts flankerende gebieden van de regio van de doelgroep in het genoom. Dergelijke lange flankeren de opeenvolgingen van zijn nodig ter verbetering van de efficiëntie van homologe recombinatie.
De sequenties van de inleidingen (up-reverse, down-forward, spcr-vooruit, en spcr-reverse) in dit protocol we…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de Japan-maatschappij voor de promotie van wetenschap [Grant nummers 16 K 15860 tot T.M. en 15 K 15777 naar N.H.].
Materials
| Streptococus mutans | Stock strain in the lab. | Wild-type strain (Strain UA159) | |
| Genomic DNA extraction kit | Zymo Research | D6005 | |
| Bead-beating disruption apparatus | Taitec | GM-01 | |
| Synthetic genes | Eurofins Genomics | Custom-ordered | Spectinomycin- and erythromycin-resistance gene |
| Thermal cycler | Astec | PC-708 | |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | 35 bases in length |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 | |
| Electroporator | Bio-rad | 1652100 | |
| Electroporation cuvette | Bio-rad | 1652086 | 0.2-cm gap |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture media |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics |
| Erythromycin | Wako | 057-07151 | Antibiotics |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
References
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Kuwayama, H., et al. PCR-mediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors. Nucleic Acids Res. 30 (2), E2 (2002).
- Sakurai, I., Mizusawa, N., Wada, H., Sato, N. Digalactosyldiacylglycerol is required for stabilization of the oxygen-evolving complex in photosystem II. Plant Physiol. 145 (4), 1361-1370 (2007).
- Aoki, H., Shiroza, T., Hayakawa, M., Sato, S., Kuramitsu, H. K. Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis. Infect Immun. 53 (3), 587-594 (1986).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutans gtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infect Immun. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Macrina, F. L., Tobian, J. A., Jones, K. R., Evans, R. P., Clewell, D. B. A cloning vector able to replicate in Escherichia coli and Streptococcus sanguis. Gene. 19 (3), 345-353 (1982).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiol Lett. 363 (11), (2016).
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infect Immun. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. J Microbiol Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. J Vis Exp. (69), (2012).
